Polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) Procédure d'expérimentation pour l'étudiant

je. Objectif

Apprenez et maîtriser les principes de base et les méthodes de détection du polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP) marqueurs génétiques.

II. Principe

La première génération de marqueurs génétiques moléculaires, RFLP, est basé sur des mutations aux sites de coupe des enzymes de restriction dans les génomes de différentes variétés (individus). Ces mutations peuvent inclure des changements de base, insertions, suppressions, ou réarrangements entre les sites de coupe enzymatique, conduisant à des variations des tailles de fragments. Ces variations peuvent être détectées par RAP, digestion enzymatique de restriction, et électrophorèse sur gel d'agarose, permettant la comparaison des différences de niveau d'ADN (c'est-à-dire, polymorphisme) entre différentes variétés (individus). RFLP a été largement utilisé dans la construction de cartes génétiques génomiques, localisation des gènes, Évolution et classification biologiques, et des études de diversité génétique.

III. Instruments, Matériaux, et réactifs

Instruments:

• Bain d'eau à température constante électrique
• Électrophorèse et système de détection du gel d'agarose

Matériaux et réactifs:

• Enzyme de restriction hind III
• 10Tampon × m
• Produit PCR à analyser
• Marqueur d'ADN DL2000
• 6× tampon de chargement
• Eau à double dissolution stérile
• 1.5% gel d'agarose (Note: Contient du bromure d'éthidium (EB), qui est cancérigène; manipuler avec des gants)
• 0.5% TBE (tampon d'électrophorèse)

Iv. Procédure

1. Digestion des enzymes de restriction hind III

   • Volume de réaction: 10 μl dans un 0.2 tube ml eppendorf
   • Ajouter ce qui suit dans l'ordre:
     • 10Tampon × m: 1 µL
     • dH2O: 5.5 µL
     • Hind III: 0.5 µL
     • Produit PCR: 3 µL
   • Digérer à 37 ℃ dans un bain-marie pour 2 heures. Utilisez l'intégralité du produit de digestion pour la détection de gel d'agarose.

2. Électrophorèse sur gel d'agarose

   • Préparer un 1.5% gel d'agarose.
   • Mélanger 10 μl du produit de digestion avec 1 μl de tampon de chargement.
   • Effectuer une électrophorèse à une tension constante de 180 V.
   • L'ADN porte une charge négative, il migrera donc du négatif vers l'électrode positive pendant l'électrophorèse.
   • Arrêter l'électrophorèse lorsque l'ADN a migré vers 1/2 à 2/3 de la longueur du gel. Observer sous un détecteur UV.

V. Affectation

Écrivez la procédure détaillée de cette expérience et décrivez les résultats que vous avez observés (y compris les dessins).