ฉัน. วัตถุประสงค์
เรียนรู้และฝึกฝนหลักการพื้นฐานและวิธีการตรวจจับของ Restriction Fragment length Polymorphism (รฟล) เครื่องหมายทางพันธุกรรม.
ครั้งที่สอง. หลักการ
เครื่องหมายทางพันธุกรรมระดับโมเลกุลรุ่นแรก, รฟล, ขึ้นอยู่กับการกลายพันธุ์ที่บริเวณตัดเอนไซม์ที่จำกัดในจีโนมของสายพันธุ์ต่างๆ (บุคคล). การกลายพันธุ์เหล่านี้อาจรวมถึงการเปลี่ยนแปลงพื้นฐานด้วย, การแทรก, การลบ, หรือการจัดเรียงใหม่ระหว่างบริเวณที่ตัดเอนไซม์, นำไปสู่การเปลี่ยนแปลงขนาดชิ้นส่วน. การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้สามารถตรวจพบได้ผ่านทาง พีซีอาร์, การจำกัดการย่อยของเอนไซม์, และอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส, ช่วยให้สามารถเปรียบเทียบความแตกต่างระดับ DNA ได้ (เช่น., ความหลากหลาย) ระหว่างพันธุ์ที่แตกต่างกัน (บุคคล). RFLP ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการสร้างแผนที่พันธุกรรมจีโนม, การแปลยีน, วิวัฒนาการและการจำแนกทางชีววิทยา, และการศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรม.
สาม. เครื่องดนตรี, วัสดุ, และรีเอเจนต์
เครื่องดนตรี:
- อ่างน้ำอุณหภูมิคงที่ไฟฟ้า
- Agarose gel electrophoresis และระบบตรวจจับ
วัสดุและรีเอเจนต์:
- เอนไซม์ข้อ จำกัด Hind III
- 10×M บัฟเฟอร์
- ผลิตภัณฑ์ PCR ที่จะวิเคราะห์
- DL2000 ดีเอ็นเอมาร์กเกอร์
- 6×กำลังโหลดบัฟเฟอร์
- น้ำกลั่นสองครั้งที่ปราศจากเชื้อ
- 1.5% เจลอะกาโรส (บันทึก: มีส่วนผสมของเอทิเดียมโบรไมด์ (อีบี), ซึ่งเป็นสารก่อมะเร็ง; จัดการกับถุงมือ)
- 0.5% จะแจ้งภายหลัง (บัฟเฟอร์อิเล็กโตรโฟรีซิส)
IV. ขั้นตอน
-
การย่อยเอนไซม์ข้อ จำกัด Hind III
- ปริมาณปฏิกิริยา: 10 ไมโครลิตรใน 0.2 มิลลิลิตร หลอดเอพเพนดอร์ฟ
- เพิ่มสิ่งต่อไปนี้ตามลำดับ:
- 10×M บัฟเฟอร์: 1 ไมโครลิตร
- ddH2O: 5.5 ไมโครลิตร
- หลัง III: 0.5 ไมโครลิตร
- ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์: 3 ไมโครลิตร
- ย่อยที่อุณหภูมิ 37°C ในอ่างน้ำสำหรับ 2 ชั่วโมง. ใช้ผลิตภัณฑ์การย่อยทั้งหมดเพื่อตรวจจับเจลอะกาโรส.
-
อะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส
- เตรียมก 1.5% เจลอะกาโรส.
- ผสม 10 μL ของผลิตภัณฑ์การย่อยด้วย 1 μL ของบัฟเฟอร์การโหลด.
- ดำเนินการอิเล็กโตรโฟรีซิสที่แรงดันไฟฟ้าคงที่ 180V.
- DNA มีประจุลบ, ดังนั้นมันจะย้ายจากขั้วลบไปยังขั้วบวกระหว่างอิเล็กโทรโฟรีซิส.
- หยุดอิเล็กโตรโฟรีซิสเมื่อ DNA ย้ายเข้าไปแล้ว 1/2 ถึง 2/3 ตามความยาวของเจล. สังเกตภายใต้เครื่องตรวจจับรังสียูวี.
วี. งานที่มอบหมาย
เขียนขั้นตอนโดยละเอียดของการทดลองนี้และอธิบายผลลัพธ์ที่คุณสังเกตเห็น (รวมถึงภาพวาด).
