Polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP) Procedura dell'esperimento per gli studenti

IO. Obiettivo

Impara e padroneggia i principi di base e i metodi di rilevamento del polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione (RFLP) marcatori genetici.

II. Principio

La prima generazione di marcatori genetici molecolari, RFLP, si basa su mutazioni nei siti di taglio degli enzimi di restrizione nei genomi di diverse varietà (individui). Queste mutazioni possono includere cambiamenti di base, inserzioni, cancellazioni, o riarrangiamenti tra i siti di taglio degli enzimi, portando a variazioni nelle dimensioni dei frammenti. Queste variazioni possono essere rilevate PCR, digestione dell'enzima di restrizione, e elettroforesi in gel di agarosio, consentendo il confronto delle differenze di livello del DNA (i.e., polimorfismo) tra varietà diverse (individui). RFLP è stato ampiamente usato nella costruzione di mappe genetiche genomiche, Localizzazione genica, Evoluzione biologica e classificazione, e studi sulla diversità genetica.

III. Strumenti, Materiali, e reagenti

Strumenti:

• Bagni d'acqua a temperatura costante elettrica
• Elettroforesi in gel di agarosio e sistema di rilevamento

Materiali e reagenti:

• Enzima di restrizione Hind III
• 10Tampone × m
• Prodotto PCR da analizzare
• Marcatore DNA DL2000
• 6× tampone di caricamento
• Acqua sterile a doppio distillata
• 1.5% gel di agarosio (Nota: Contiene bromuro di etidio (Eb), che è cancerogeno; maneggiare con guanti)
• 0.5% Tbe (tampone elettroforesi)

IV. Procedura

1. Digestione dell'enzima di restrizione III.

   • Volume di reazione: 10 μl in a 0.2 ML Eppendorf Tube
   • Aggiungi quanto segue in ordine:
     • 10Tampone × m: 1 μL
     • ddH2O: 5.5 μL
     • Hind III: 0.5 μL
     • Prodotto PCR: 3 μL
   • Digerire a 37 ℃ a bagno d'acqua per 2 ore. Utilizzare l'intero prodotto di digestione per il rilevamento di gel di agarosio.

2. Elettroforesi in gel di agarosio

   • Preparare un 1.5% gel di agarosio.
   • Mescolare 10 μl del prodotto di digestione con 1 μl di tampone di carico.
   • Eseguire elettroforesi a una tensione costante di 180 V.
   • Il DNA porta una carica negativa, Quindi migrerà dall'elettrodo negativo all'elettrodo positivo durante l'elettroforesi.
   • Arrestare l'elettroforesi quando il DNA è migrato 1/2 A 2/3 della lunghezza del gel. Osservare sotto un rilevatore UV.

V. Incarico

Scrivi la procedura dettagliata di questo esperimento e descrivi i risultati osservati (compresi i disegni).