Что такое ПЦР на месте? Для чего он используется для?

На площадке ПЦР, или полимеразная цепная реакция на месте, это метод, используемый в научных исследованиях. Каждая новая технология, разработанная в науке, приносит ряд новых результатов исследований., тем самым способствуя развитию различных дисциплин.

Разработка ПЦР на месте

• В 1950 -х годах, Введение электронной микроскопии в морфологическое наблюдение привело к углубленным исследованиям от клеточного уровня до субклеточного уровня.
• В 1960 -х и 1970 -х годах, Широкое применение методов иммуногистохимии и иммуноцитохимии подтолкнуло наблюдение из субклеточных структур к уровню молекул белка, разрешение локализации многочисленных активных веществ в клетках или на субклеточном уровне, глубокое влияние на развитие медицинской биологии.
• В 1970 -х годах, Обширное применение методов молекулярной биологии в морфологии, наряду с появлением технологии гибридизации на месте, Включил локализацию специфических последовательностей ДНК или РНК в тканевых клетках, повышение уровня наблюдения и локализации от белков до генетического уровня, а именно молекулы нуклеиновой кислоты. Это углубленное человеческое понимание многих биологических явлений на генетическом уровне.
• В 1980 -х годах, ПЦР (полимеразной цепной реакции), надежная жизненно важная техника в области молекулярной биологии, появился. Он был быстро введен в область морфологического наблюдения, Включение локализации и наблюдения специфической ДНК или РНК с низким количеством копий или отдельных копий в клетках. Появление этой техники обязательно принесет больше результатов исследований, продвижение морфологических исследований вперед значительным шагом.

Принципы ПЦР на месте

• Основной принцип: ПЦР на месте объединяет высокоэффективную амплификацию ПЦР с клеточной локализацией гибридизации на месте для обнаружения специфических последовательностей ДНК или РНК в тканевых клетках.
• Техника ПЦР: Использует ДНК -полимеразу для амплификации специфических последовательностей мишеней посредством денатурации, отжиг, и циклы расширения, приводя к высокочувствительному и специфическому усилению.
• Ограничения традиционной ПЦР: Традиционная ПЦР проводится в жидкой фазе, требующие разрушения клеток и экстракции нуклеиновых кислот перед амплификацией, что затрудняет корреляцию результатов ПЦР с клеточной морфологией и идентификацию типов клеток, содержащих определенные целевые последовательности..
• Преимущества ПЦР in-situ: Сочетает в себе сильные стороны методов ПЦР и гибридизации in-situ, преодолевая при этом их соответствующие ограничения..
• Процедура: Образцы тканей химически фиксируются для сохранения клеточной морфологии.. Проницаемость клеточных и ядерных мембран позволяет компонентам ПЦР проникать в клетки или ядра., где они амплифицируют РНК или ДНК, фиксированную in situ. Усиленные продукты, обычно большие молекулы или переплетенные структуры, сохраняются in situ и легко обнаруживаются путем гибридизации in situ..
• Преимущества: Обеспечивает экспоненциальную амплификацию определенных последовательностей ДНК или РНК внутри клеток., облегчение их обнаружения посредством гибридизации in-situ.

Основные типы ПЦР in-situ

Методы ПЦР in-situ можно разделить на два основных типа.: прямой метод и косвенный метод, в зависимости от того, помечены ли трифосфатные нуклеотиды или праймеры, используемые в реакции амплификации.. Кроме того, существует метод ПЦР с обратной транскрипцией in-situ..

Прямой метод ПЦР-техника на месте:

• В прямом методе, продукты амплификации напрямую метятся маркерными молекулами, такие как меченый трифосфат-аденозин или фрагменты праймера. Во время ПЦР-амплификации образца, меченые молекулы включаются в амплифицированные продукты, позволяющая визуализировать конкретную ДНК или РНК в образце (на месте).
• Общие маркеры включают радиоактивные изотопы, такие как 35S., биотин, и дигоксигенин. Эти маркеры’ места можно обнаружить с помощью таких методов, как авторадиография для радиоактивных изотопов или химия аффинных тканей и иммуногистохимия для биотина и дигоксигенина..
• К преимуществам прямого метода относится простота., более короткое время обработки, и простота эксплуатации. Однако, у него есть такие недостатки, как более низкая специфичность, более высокая вероятность ложных срабатываний, и более низкая эффективность усиления, особенно на парафиновых срезах, где повреждение ДНК во время срезов может привести к ложноположительным результатам..
• Непрямой метод. Методика ПЦР in-situ.:

Непрямой метод ПЦР-техники на месте:

• В непрямом методе, специфическая амплификация ДНК или РНК сначала выполняется внутри клеток, с последующей гибридизацией in-situ с использованием меченых зондов, значительно улучшает специфичность. В настоящее время это наиболее широко используемый метод ПЦР in-situ..
• В отличие от прямого метода, система реакции аналогична обычной ПЦР, без использования меченых праймеров или трифосфатаденозина. Цель состоит в том, чтобы сначала усилить, затем обнаружить специфические продукты ДНК, амплифицированные внутри клеток, с использованием технологии гибридизации in-situ.. Он эффективно сочетает в себе методы ПЦР и гибридизации in-situ., также известный как ПЦР-гибридизация in-situ (ПРИГОТОВЛЕНИЕ).
• К преимуществам непрямого метода относятся более высокая специфичность и эффективность амплификации., но он включает в себя более сложные операционные этапы, чем прямой метод.

Техника ПЦР обратной транскрипции на месте:

• ПЦР с обратной транскрипцией in-situ (RT-PCR in situ) это новый метод, который применяет технологию жидкофазной RT-PCR к образцам тканевых клеток.. В отличие от жидкофазной RT-PCR, образцы тканей обрабатываются ферментами ДНК перед ПЦР с обратной транскрипцией in-situ для разрушения ДНК ткани., обеспечение того, что амплифицированная матрица представляет собой кДНК, синтезированную из мРНК, не оригинальная ДНК в клетках. Другие основные этапы аналогичны жидкофазной RT-PCR..

Как запустить тест на ПЦР на месте?

Основные этапы технологии ПЦР in-situ включают подготовку проб., усиление на месте (ПЦР), и обнаружение на месте, как указано ниже (с акцентом на парафиновые срезы):

Базовые приготовления:

• Методы ПЦР in-situ можно применять к клеточным суспензиям., клеточные мазки, замороженные секции, и парафиновые срезы.
• По сравнению с другими методами, ПЦР in-situ дает наилучшие результаты для суспендированных неповрежденных клеток., в то время как парафиновые срезы дают самые плохие результаты.
• Некоторые причины плохой производительности включают в себя:
  • Плохая теплопроводность и неравномерная конвекция тепла при проведении ПЦР на предметных стеклах..
  • Адсорбция фермента Taq ДНК на предметных стеклах.
  • После обработки образца, в клетках отсутствует неповрежденная цитоплазма или ядерные мембраны, что приводит к диффузии продуктов амплификации и затруднению их удержания in situ..
• Большинство образцов патологий фиксируются формалином и консервируются в парафине..
• Решение технических вопросов, связанных с ПЦР in-situ на парафиновых срезах, имело бы большое значение..

Фиксация клеток ткани: Тканевые клетки обычно фиксируются с помощью 10% забуференный формалин или 4% параформальдегид для лучших результатов при ПЦР in-situ. Время фиксации не должно быть слишком продолжительным., обычно 4-6 часы при 4°C.

Толщина среза: Более толстые срезы обычно дают лучшие результаты при ПЦР in-situ, поскольку они содержат больше целевой ДНК и мембранных структур., предотвращение диффузии продуктов амплификации. Однако, более толстые срезы могут привести к большему перекрытию клеток и снижению разрешения при морфологическом наблюдении..

Слайд-обработка: Для предотвращения отслоения парафиновых срезов во время ПЦР и гибридизации in-situ., слайды следует обрабатывать, чтобы предотвратить отслоение. Общие методы включают покрытие поли-L-лизином или силанизацию., которые обычно предотвращают отслоение тканей.

Протеазное пищеварение:

Усиление на месте (ПЦР): Амплификация на месте включает в себя проведение реакций ПЦР на образцах тканевых клеток, С базовым принципом такой же, как и у жидкой фазы ПЦР. Праймеры, используемые в ПЦР, обычно 15-30bp, и амплифицированные фрагменты около 100-1000 п.н..

Система реакции:

• Система реакции для ПЦР на месте аналогична системе обычной ПЦР жидкой фазы.
• Более высокие концентрации праймеров, Такдна полимераза, и MG2+ предложены для лучших результатов амплификации на срезах фиксированных тканей по сравнению с системами ПЦР-фазы жидкости.
• Бычий сывороточный альбумин (BSA) следует добавить в реакционную систему, чтобы предотвратить связывание ДНК -полимеразы TAQ.

Термальный велоспорт:

• Тепловая цикл для ПЦР на месте может быть выполнена в специализированном термическом циклере или в обычном термическом циклере ПЦР.
• Каждый этап термоциклирования ПЦР in-situ может быть немного длиннее, чем в обычной ПЦР, чтобы обеспечить адекватную амплификацию..
• Для минимизации потерь реакционной системы во время термоциклирования можно использовать метод горячего старта..

Мойка:

• После амплификации in-situ, образцы должны быть промыты для удаления продуктов амплификации, диффундировавших за пределы клеток..
• Недостаточная промывка может привести к визуализации продуктов амплификации во время обнаружения., что приводит к чрезмерно темному фону или ложноположительным результатам.
• Чрезмерное промывание также может привести к удалению амплифицированных продуктов внутри клеток., ослабление или потеря положительных сигналов.

Постфиксация: Некоторые авторы сообщают об использовании 4% параформальдегид для 2 часов или 2% глутаровый альдегид для 5 Протокол после фиксирования после амплификации, чтобы гарантировать, что амплифицированные продукты хорошо сохраняются в клетках во время обнаружения, тем самым улучшая чувствительность и специфичность обнаружения.

Обнаружение на месте: Метод обнаружения продуктов амплификации ПЦР на месте зависит от проектирования протокола ПЦР на месте. Прямые методы непосредственно обнаруживают амплифицированные продукты на основе природы меченых молекул, в то время как косвенные методы требуют обнаружения через гибридизацию на месте.

Применение ПЦР на месте

Обнаружение экзогенных генов

• Обнаружение вирусных генов:
  • В клетках, инфицированных вирусами, Обнаружение может быть сложным. Однако, ПЦР на месте дает надежду на решение этой трудности.
  • ПЦР на месте была успешно применена для наблюдения за роли различных вирусов, таких как ВИЧ, HPV, HSV, HBV, ВГС, и т. д., в таких условиях, как СПИД, Опухоли репродуктивной системы, гепатит, и рак печени, Включение своевременной идентификации инфицированных людей.
• Обнаружение бактериальных генов:
  • Видимое применение в обнаружении Mycobacterium tuberculosis. Когда поражения туберкулеза нетипичны, Сложно определить бактерии под микроскопом, используя специальные методы окрашивания. ПЦР на месте может помочь в достижении окончательного диагноза, Даже когда присутствие микобактерии туберкулеза минимально.
• Обнаружение импортированных генов:
  • В изучении трансгенных животных, Подтверждение импорта генов, а также у пациентов, проходящих генную терапию, можно проверить с помощью ПЦР на месте. Таким образом, ПЦР на месте стала важным методом обнаружения.

Обнаружение эндогенных генов

Обнаружение аномальных генов:

• Обнаружение мутации и перестройки:
  • ПЦР на месте способна обнаруживать мутации и перестройки в генах в организме.
  • Мутации в протоонкогенах и генах-супрессорах опухолей, а также реаранжировки генов тяжелой цепи иммуноглобулина, являются примерами генетических изменений, обнаруженных с помощью ПЦР in-situ..
• Применение в исследовании и диагностике рака:
  • Эти мутации и перестройки играют решающую роль в развитии и прогрессировании рака..
  • ПЦР in-situ предлагает широкие возможности для исследования и диагностики рака, позволяя точно выявлять эти генетические изменения..
  • Это облегчает понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе рака, и помогает в разработке таргетной терапии..

Обнаружение конститутивных генов:

• Проблемы низкоуровневой экспрессии генов:
  • Конститутивные гены, экспрессируемые на низких уровнях, создают проблемы для методов обнаружения..
  • Методы гибридизации in-situ неэффективны из-за ограниченного количества копий генов в клетках организма..
• Ограничения жидкофазной ПЦР:
  • Жидкофазная ПЦР может амплифицировать и обнаруживать гены низкого уровня, но ей не хватает специфичности к типу клеток..
  • Он не может точно определить, какой тип клеток содержит целевой ген..
• Преимущества ПЦР in-situ:
  • ПЦР in-situ преодолевает эти ограничения..
  • Это позволяет обнаруживать различные гены человека., даже те, которые выражены на низком уровне.
  • ПЦР in-situ способствует составлению карты генов человека, обеспечивая точную локализацию генов в определенных типах клеток..