In-situ PCRとは? 何に使うのか?

インサイト PCR, または in situ ポリメラーゼ連鎖反応, 科学研究で使用される技術です. 科学で開発された各新しいテクノロジーは、一連の新しい研究結果をもたらします, それにより、さまざまな分野の進歩を推進します.

in-situ PCRの開発

• 1950年代, 形態学的観察への電子顕微鏡検査の導入により、細胞レベルから細胞内レベルへの詳細な研究がもたらされました.
• 1960年代と1970年代, 免疫組織化学および免疫細胞化学技術の広範な適用により、観察は細胞内構造からタンパク質分子のレベルに押し上げられました。, 細胞内または細胞内レベルで多数の活性物質の局在を許可する, 医学生物学の開発に深く影響を与えます.
• 1970年代, 形態における分子生物学技術の広範な応用, in-situハイブリダイゼーション技術の出現に加えて, 組織細胞内の特定のDNAまたはRNA配列の局在を有効にしました, タンパク質から遺伝的レベルへの観察と局在のレベルを上げる, すなわち、核酸分子. 遺伝的レベルでの多くの生物学的現象のこの深みのある人間の理解.
• 1980年代, PCR (ポリメラーゼ連鎖反応), 分子生物学の分野での堅牢な重要な技術, 出現した. それはすぐに形態学的観察の分野に導入されました, セル内のコピー数または単一コピーを使用して、特定のDNAまたはRNAの局在と観察を可能にします. この手法の出現は、より多くの研究結果を生み出すことになります, 大きな歩みによって形態学的研究を推進する.

in-situ pcrの原則

• 基本原則: in-situ PCRは、PCRの高効率増幅と、組織細胞内の特定のDNAまたはRNA配列を検出するために、in-situハイブリダイゼーションの細胞局在化を組み合わせています。.
• PCRテクニック: DNAポリメラーゼを利用して、変性を通じて特定の標的配列を増幅します, アニーリング, および拡張サイクル, その結果、非常に敏感で特異的な増幅が生じます.
• 従来のPCRの制限: 従来のPCRは液相で行われます, 増幅前に細胞の破壊と核酸抽出が必要です, PCRの結果を細胞形態と相関させ、特定のターゲットシーケンスを含む細胞タイプを特定することを困難にします.
• in-situ PCRの利点: それぞれの制限を克服しながら、PCRと現場のハイブリダイゼーション技術の強さを組み合わせます.
• 手順: 組織サンプルは、細胞の形態を維持するために化学的に固定されています. 細胞および核膜の透過性により、PCR成分は細胞または核に入ることができます, それらがin situで固定されたRNAまたはDNAを増幅する場合. 増幅された製品, 通常、大きな分子または織り込まれた構造, その場で保持され、in-situハイブリダイゼーションによって簡単に検出されます.
• 利点: 細胞内の特定のDNAまたはRNA配列の指数増幅を有効にします, in-situハイブリダイゼーションを介して検出を促進します.

基本タイプ in-situ pcrの

in-situ PCRテクニックは、2つの主要なタイプに分類できます: 直接的な方法と間接的な方法, 増幅反応で使用されている三リン酸ヌクレオチドまたはプライマーに標識されるかどうかに基づいて. さらに, 逆転写in-situ PCR技術があります.

直接メソッドin-situ PCR手法:

• 直接的な方法で, 増幅産物は、マーカー分子で直接標識されます, 標識された三リン酸アデノシンまたはプライマーフラグメントなど. 標本のPCR増幅中, 標識分子は、増幅された生成物に組み込まれています, 標本内の特定のDNAまたはRNAの視覚化を有効にする (インサイト).
• 一般的なマーカーには、35秒のような放射性同位体が含まれます, ビオチン, およびジゴキシゲニン. これらのマーカー’ 場所は、放射性同位体のオートラジオグラフィーや、ビオチンおよびジゴキシゲニンの免疫組織化学のためのオートラジオグラフィーなどの方法を使用して検出できます。.
• 直接的な方法の利点には、単純さが含まれます, より短い処理時間, 操作の容易さ. しかし, 特異性が低いなどの短所があります, 誤検知の可能性が高い, より低い増幅効率, 特に、セクション中のDNA損傷が誤検知につながる可能性のあるパラフィンセクションで.
• 間接的なメソッドin-situ PCR手法:

間接的なメソッドin-situ PCR手法:

• 間接的な方法で, 特定のDNAまたはRNA増幅は、最初に細胞内で実行されます, その後、標識プローブを使用したin-situハイブリダイゼーションが続きます, 特異性を大幅に改善します. 現在、最も広く使用されているin-situ PCRテクニックです.
• 直接的な方法とは異なります, 反応システムは、従来のPCRに似ています, 標識されたプライマーまたは三リン酸アデノシンが使用されていません. 目的は、最初に増幅することです, 次に、in-situハイブリダイゼーション技術を使用して細胞内で増幅された特定のDNA製品を検出します. PCRと現場のハイブリダイゼーション技術を効果的に組み合わせています, PCR in-situハイブリダイゼーションとしても知られています (打者).
• 間接的な方法の利点には、より高い特異性と増幅効率が含まれます, しかし、それは直接的な方法よりも複雑な運用手順を伴います.

in-situ逆転写PCR技術:

• in-situ逆転写PCR (in situ rt-pcr) 液相RT-PCRテクノロジーを組織細胞サンプルに適用する新しい手法です. 液相RT-PCRとは異なります, 組織サンプルは、組織DNAを破壊するために、in-situ逆転写PCRの前にDNA酵素で処理されます, 増幅されたテンプレートがmRNAから合成されていることを確認する, 細胞内の元のDNAではありません. 他の基本的な手順は、液相RT-PCRに似ています.

in-situ PCRテストの実行方法?

in-situ PCRテクノロジーの基本的な手順には、サンプルの準備が含まれています, in-situ増幅 (PCR), およびin-situ検出, 以下に概説するように (パラフィンセクションに焦点を当てています):

サンプルの準備:

• in-situ PCR技術は、細胞懸濁液に適用できます, 細胞塗抹標本, 冷凍セクション, およびパラフィンセクション.
• 他の方法と比較して, in-situ PCRは、無傷の細胞が懸濁して最良の結果をもたらします, 一方、パラフィンセクションは最も貧弱な結果をもたらします.
• パフォーマンスの低下の理由には含まれます:
  • スライドでPCRを行うときの熱伝導率と不均一な熱対流.
  • ガラススライドへのTaq DNA酵素吸着.
  • サンプル処理後, 細胞は無傷の細胞質または核膜を欠いています, 増幅製品の拡散につながり、それらをその場で保持するのが困難.
• ほとんどの病理標本はホルマリンで固定され、パラフィンで保存されています.
• パラフィンセクションでin-situ PCRに関連する技術的な問題を解決することは非常に重要です.

組織細胞固定: 組織細胞は通常固定されています 10% 緩衝型ホルマリンまたは 4% パラホルムアルデヒドin-situ PCRでより良い結果を得る. 固定時間は過度に長くはあってはなりません, 通常 4-6 4°Cでの時間.

スライスの厚さ: より厚いスライスは一般に、より多くの標的DNAと膜構造を含むため、in-situ PCRでより良い結果をもたらします, 増幅産物の拡散を防ぐ. しかし, スライスが厚くなると、細胞の重複が増加し、形態学的観察の分解能が低下する可能性があります.

スライドトリートメント: PCRおよびin-situハイブリダイゼーション中のパラフィン切片の剥離を防ぐため, 剥離を防ぐためにスライドを処理する必要があります. 一般的な方法には、ポリ-L-リジンでのコーティングまたはシラン化治療が含まれます, 通常、組織の剥離を防ぎます.

プロテアーゼ消化:

in-situ増幅 (PCR): in-situ増幅には、組織細胞標本に対するPCR反応の実施が含まれます, 基本原理は液相PCRと同じです. PCRで使用されるプライマーは、通常15〜30bpです, 増幅されたフラグメントは約100〜1000bpです.

反応システム:

• in-situ PCRの反応システムは、従来の液相PCRの反応システムに似ています.
• より高い濃度のプライマー, TaqDNAポリメラーゼ, Mg2+は、液相PCRシステムと比較して、固定組織スライスのより良い増幅結果のために提案されています.
• ウシ血清アルブミン (BSA) TAQ DNAポリメラーゼがガラススライドに結合し、増幅効率を低下させるのを防ぐために、反応システムに追加する必要があります.

サーマルサイクリング:

• in-situ PCRのサーマルサイクリングは、特殊なサーマルサイクラーまたは通常のPCRサーマルサイクラーで行うことができます.
• 適切な増幅を確保するために、in-situ PCRのサーマルサイクリングの各ステップは、従来のPCRよりもわずかに長い場合があります.
• 熱サイクリング中の反応システムの損失を最小限に抑えるために、ホットスタート方法を使用できます.

洗浄:

• in-situ増幅後, サンプルは洗浄を受けて、外側の細胞を拡散した増幅製品を除去する必要があります.
• 不十分な洗浄は、検出中に増幅産物の視覚化につながる可能性があります, その結果、過度に暗い背景または偽陽性の結果が得られます.
• 過度の洗浄は、細胞内で増幅された生成物が除去される可能性もあります, 正の信号を弱めたり失ったりします.

修正後: 一部の著者は、使用を報告しています 4% パラホルムアルデヒド用 2 時間または 2% グルタルアルデヒドの 5 増幅後の修正後の議事録は、検出中に増幅された生成物が細胞に十分に保持されるようにするために, これにより、検出の感度と特異性が向上します.

in-situ検出: in-situ PCRの増幅産物を検出する方法は、in-situ PCRプロトコルの設計に依存します. 直接的な方法は、標識分子の性質に基づいて増幅された製品を直接検出します, 間接的な方法では、現場のハイブリダイゼーションによる検出が必要です.

in-situ PCRの適用

外因性遺伝子の検出

• ウイルス遺伝子の検出:
  • ウイルスに感染した細胞で, 検出は困難な場合があります. しかし, in-situ PCRは、この困難に対処する希望を提供します.
  • in-situ PCRは、HIVなどのさまざまなウイルスの役割を観察するために正常に適用されています, HPV, HSV, HBV, HCV, 等, エイズのような条件で, 生殖系腫瘍, 肝炎, および肝臓がん, 感染した個人のタイムリーな識別を可能にします.
• 細菌遺伝子の検出:
  • 顕著な用途は、結核菌の検出中です. 結核病変が非定型である場合, 特別な染色方法を使用して、顕微鏡下で細菌を識別するのは難しいです. in-situ PCRは、決定的な診断を行うのに役立ちます, 結核菌の存在が最小限であっても.
• インポートされた遺伝子の検出:
  • トランスジェニック動物の研究, 遺伝子輸入の確認, 遺伝子治療を受けている患者と同様に, in-situ pcrを使用して検証できます. したがって, in-situ PCRは重要な検出方法になりました.

内因性遺伝子の検出

異常な遺伝子の検出:

• 突然変異と再配置の検出:
  • in-situ PCRは、体内の遺伝子の突然変異と再配置を検出することができます.
  • プロトオンコゲンおよび腫瘍抑制遺伝子の変異, 免疫グロブリン重鎖遺伝子の再配列と同様に, in-situ PCRを使用して検出された遺伝的変化の例です.
• 癌の研究と診断の応用:
  • これらの変異と再配列は、癌の発生と進行において重要な役割を果たします.
  • in-situ PCRは、これらの遺伝的変化の正確な検出を可能にすることにより、がん研究と診断における幅広いアプリケーションを提供します.
  • 癌の根底にある分子メカニズムの理解を促進し、標的療法の開発において助けます.

構成遺伝子の検出:

• 低レベルの遺伝子発現の課題:
  • 低レベルで発現する構成遺伝子は、検出方法に課題をもたらします.
  • 体細胞の遺伝子コピー数が限られているため、in-situハイブリダイゼーション技術は効果がありません.
• 液相PCRの制限:
  • 液相PCRは、低レベルの遺伝子を増幅および検出できますが、細胞型の特異性を欠いています.
  • どの細胞型が標的遺伝子を正確に含むかを決定することはできません.
• in-situ PCRの利点:
  • in-situ PCRはこれらの制限を克服します.
  • さまざまなヒト遺伝子の検出を可能にします, 低レベルで表現されたものでさえ.
  • in-situ PCRは、特定の細胞タイプ内で正確な遺伝子局在化を提供することにより、ヒト遺伝子マップの完成に貢献します.