Was ist in-situ pcr? Was benutzt es für?

In-Site PCR, oder In-situ-Polymerasekettenreaktion, ist eine Technik in der wissenschaftlichen Forschung. Jede neue Technologie, die in der Wissenschaft entwickelt wurde, bringt eine Reihe neuer Forschungsergebnisse hervor, Dadurch die Weiterentwicklung verschiedener Disziplinen voranzutreiben.

Die Entwicklung der In-situ-PCR

• In den 1950er Jahren, Die Einführung der Elektronenmikroskopie in die morphologische Beobachtung brachte eine eingehende Forschung von zellulärer Ebene auf die subzelluläre Ebene.
• In den 1960er und 1970er Jahren, Die weit verbreitete Anwendung von Immunhistochemie- und Immunzytochemie -Techniken drückte die Beobachtung von subzellulären Strukturen auf das Niveau der Proteinmoleküle, Ermöglichen der Lokalisierung zahlreicher aktiver Substanzen in Zellen oder auf subzellulärer Ebene, zutiefst die Entwicklung der medizinischen Biologie beeinflussen.
• In den 1970er Jahren, Die umfassende Anwendung von molekularen Biologie -Techniken in der Morphologie, zusammen mit der Entstehung der In-situ-Hybridisierungstechnologie, ermöglichte die Lokalisierung spezifischer DNA- oder RNA -Sequenzen in Gewebezellen, Erhöhung des Beobachtungs- und Lokalisierungsniveaus von Proteinen auf das genetische Niveau, nämlich Nukleinsäuremoleküle. Dieses vertiefte das menschliche Verständnis vieler biologischer Phänomene auf genetischer Ebene.
• In den 1980er Jahren, PCR (Polymerase-Kettenreaktion), Eine robust wichtige Technik im Bereich der molekularen Biologie, tauchte auf. Es wurde schnell in den Bereich der morphologischen Beobachtung eingeführt, Aktivierung der Lokalisierung und Beobachtung spezifischer DNA oder RNA mit geringen Kopienzahlen oder einzelnen Kopien innerhalb von Zellen. Das Aufkommen dieser Technik wird zwangsläufig mehr Forschungsergebnisse hervorbringen, morphologische Studien durch einen signifikanten Schritt vorantreiben.

Die Prinzipien der In-situ-PCR

• Grundprinzip: In-situ-PCR kombiniert die hohe Effizienzverstärkung von PCR mit der zellulären Lokalisierung der In-situ-Hybridisierung, um spezifische DNA- oder RNA-Sequenzen in Gewebezellen nachzuweisen.
• PCR -Technik: Verwendet die DNA -Polymerase, um spezifische Zielsequenzen durch Denaturierung zu amplifizieren, Glühen, und Verlängerungszyklen, was zu hochempfindlicher und spezifischer Verstärkung führt.
• Einschränkungen der traditionellen PCR: Die traditionelle PCR wird in einer flüssigen Phase durchgeführt, Vor der Verstärkung müssen Zellstörungen und Nukleinsäureextraktion erforderlich sein, Es ist schwierig, PCR -Ergebnisse mit der zellulären Morphologie zu korrelieren und Zelltypen zu identifizieren, die spezifische Zielsequenzen enthalten.
• Vorteile der In-situ-PCR: Kombiniert die Stärken von PCR- und In-situ-Hybridisierungstechniken und überwindet ihre jeweiligen Einschränkungen.
• Verfahren: Gewebeproben sind chemisch fixiert, um die zelluläre Morphologie aufrechtzuerhalten. Die Permeabilität von Zell- und Kernmembranen ermöglicht es PCR -Komponenten, in Zellen oder Kerne zu gelangen, wo sie RNA oder DNA, die in situ festgelegt werden. Verstärkte Produkte, Typischerweise große Moleküle oder verwobene Strukturen, werden in situ behalten und durch In-situ-Hybridisierung leicht erkannt.
• Vorteile: Ermöglicht die exponentielle Amplifikation spezifischer DNA- oder RNA -Sequenzen in Zellen, Erleichterung ihrer Erkennung durch In-situ-Hybridisierung.

Grundtypen von In-situ PCR

In-situ-PCR-Techniken können in zwei Haupttypen eingeteilt werden: Direkte Methode und indirekte Methode, Basierend darauf, ob die in der Amplifikationsreaktion verwendeten Triphosphat -Nukleotide oder Primer markiert sind. Zusätzlich, Es gibt die umgekehrte Transkriptions-In-situ-PCR-Technik.

Direkte Methode In-situ PCR-Technik:

• In der direkten Methode, Die Amplifikationsprodukte sind direkt mit Markermolekülen markiert, wie markierte Triphosphat -Adenosin- oder Primerfragmente. Während der PCR -Verstärkung des Probens, Die markierten Moleküle sind in die amplifizierten Produkte eingebaut, Aktivierung der Visualisierung spezifischer DNA oder RNA in der Probe (In-Site).
• Häufige Marker sind radioaktive Isotope wie 35s, Biotin, und Digoxigenin. Diese Marker‘ Standorte können unter Verwendung von Methoden wie Autoradiographie für radioaktive Isotope oder Affinitätsgewebechemie und Immunhistochemie für Biotin und Digoxigenin nachgewiesen werden.
• Zu den Vorteilen der direkten Methode gehört die Einfachheit, Kürzere Verarbeitungszeit, und einfache Betrieb. Jedoch, Es hat Nachteile wie niedrigere Spezifität, höhere Wahrscheinlichkeit von falsch positiven Aspekten, und niedrigere Amplifikationseffizienz, insbesondere in Paraffinabschnitten, in denen DNA -Schäden während des Schneidens zu falsch positiven Aspekten führen können.
• Indirekte Methode in situ PCR-Technik:

Indirekte Methode in situ PCR-Technik:

• In der indirekten Methode, Spezifische DNA- oder RNA -Amplifikation werden zuerst innerhalb von Zellen durchgeführt, gefolgt von In-situ-Hybridisierung unter Verwendung markierter Sonden, signifikant Verbesserung der Spezifität. Es ist derzeit die am häufigsten verwendete In-situ-PCR-Technik.
• Im Gegensatz zur direkten Methode, Das Reaktionssystem ähnelt der herkömmlichen PCR, ohne markierte Primer oder Triphosphat -Adenosin verwendet. Ziel ist es, zuerst zu verstärken, dann die spezifischen DNA-Produkte nach Erfindung der in Zellen amplifizierten In-situ-Hybridisierungstechnologie nachweisen. Es kombiniert effektiv PCR- und In-situ-Hybridisierungstechniken, Auch als PCR-In-situ-Hybridisierung bekannt (Teig).
• Die Vorteile der indirekten Methode umfassen eine höhere Spezifität und die Amplifikationseffizienz, Es handelt sich jedoch um komplexere Betriebsschritte als die direkte Methode.

In-situ Reverse Transcription PCR-Technik:

• In-situ Reverse Transcription PCR (In-situ RT-PCR) ist eine neue Technik, die die Flüssigphasen-RT-PCR-Technologie auf Gewebezellproben anwendet. Im Gegensatz zu Flüssigkeitsphasen-RT-PCR, Gewebeproben werden vor der In-situ-Reverse-Transkriptions-PCR mit DNA-Enzymen behandelt, um die Gewebe-DNA zu zerstören, Sicherstellen, dass die amplifizierte Vorlage cDNA aus mRNA synthetisiert wird, nicht die ursprüngliche DNA in Zellen. Andere grundlegende Schritte ähneln der Flüssigphasen-RT-PCR.

So führen Sie einen In-situ-PCR-Test aus?

Zu den grundlegenden Schritten der In-situ-PCR-Technologie gehören die Probenvorbereitung, In-situ-Verstärkung (PCR), und In-situ-Erkennung, Wie unten beschrieben (mit einem Fokus auf Paraffinabschnitte):

Probenvorbereitung:

• In-situ-PCR-Techniken können auf Zellsuspensionen angewendet werden, Zellabstriche, gefrorene Abschnitte, und Paraffinabschnitte.
• Im Vergleich zu anderen Methoden, In-situ PCR liefert die besten Ergebnisse mit suspendierten intakten Zellen, während Paraffinabschnitte die ärmsten Ergebnisse liefern.
• Einige Gründe für schlechte Leistung sind:
  • Schlechte thermische Leitfähigkeit und ungleichmäßige Hitzekonvektion bei der Durchführung von PCR auf Objektträgern.
  • Taq -DNA -Enzymadsorption an Glasrutschen.
  • Nach der Probenverarbeitung, Zellen fehlen intaktes Zytoplasma oder Kernmembranen, was zur Verbreitung von Verstärkungsprodukten und Schwierigkeiten, sie in situ zu halten, führt.
• Die meisten pathologischen Exemplare sind mit Formalin fixiert und in Paraffin aufbewahrt.
• Die Lösung technischer Probleme im Zusammenhang mit der In-situ-PCR in Paraffinabschnitten wäre von hoher Bedeutung.

Gewebezellfixierung: Gewebezellen werden normalerweise mit fixiert mit 10% gepuffertes Formalin oder 4% Paraformaldehyd für bessere Ergebnisse bei der In-situ-PCR. Die Fixierungszeit sollte nicht übermäßig lang sein, Typischerweise 4-6 Stunden bei 4 ° C..

Scheibendicke: Dickere Schnitte liefern im Allgemeinen bessere Ergebnisse bei In-situ-PCR, da sie mehr Ziel-DNA- und Membranstrukturen enthalten, Verhinderung der Verbreitung von Verstärkungsprodukten. Jedoch, Dickere Schnitte können zu mehr Zellüberlappung und einer verminderten Auflösung bei morphologischer Beobachtung führen.

Foliebehandlung: Um die Ablösung von Paraffinschnitten während der PCR- und In-situ-Hybridisierung zu verhindern, Folien sollten behandelt werden, um die Ablösung zu verhindern. Zu den häufigen Methoden gehört die Beschichtung mit Poly-L-Lysin oder Silanisierungsbehandlung, die im Allgemeinen die Ablösung der Gewebe verhindern.

Protease -Verdauung:

In-situ-Verstärkung (PCR): In-situ-Amplifikation beinhaltet die Durchführung von PCR-Reaktionen auf Gewebezellproben, wobei das Grundprinzip das gleiche wie das von Flüssigphasen-PCR ist. Die in PCR verwendeten Primer sind im Allgemeinen 15-30 bp, und die verstärkten Fragmente liegen bei etwa 100-1000 bp.

Reaktionssystem:

• Das Reaktionssystem für In-situ-PCR ähnelt dem der herkömmlichen Flüssigphasen-PCR.
• Höhere Konzentrationen von Primern, TaqDNA -Polymerase, und MG2+ werden für bessere Amplifikationsergebnisse an festen Gewebeschnitten im Vergleich zu Flüssigphasen-PCR-Systemen vorgeschlagen.
• Rinder -Serumalbumin (BSA) sollte dem Reaktionssystem gegeben werden, um zu verhindern, dass die Taq -DNA -Polymerase an Glasobjektträger bin.

Thermalradfahren:

• Thermischer Radfahren für die PCR in situ.
• Jeder Schritt im thermischen Radfahren von In-situ-PCR kann etwas länger sein als bei der herkömmlichen PCR, um eine angemessene Verstärkung zu gewährleisten.
• Es kann eine heiße Startmethode angewendet werden, um den Verlust des Reaktionssystems während des Wärmezyklus zu minimieren.

Waschen:

• Nach der In-situ-Verstärkung, Proben sollten sich waschen, um Verstärkungsprodukte zu entfernen, die außerhalb der Zellen diffus.
• Eine unzureichende Wäsche kann zur Visualisierung von Verstärkungsprodukten während der Erkennung führen, was zu übermäßig dunklen Hintergründen oder falsch positiven Ergebnissen führt.
• Übermäßiges Waschen kann auch zur Entfernung verstärkter Produkte in Zellen führen, positive Signale schwächen oder verlieren.

Nach der Fixierung: Einige Autoren haben berichtet, 4% Paraformaldehyd für 2 Stunden oder 2% Glutaraldehyd für 5 Protokoll für die Nachaussetzung nach der Verstärkung, um sicherzustellen, Dadurch Verbesserung der Empfindlichkeit und Spezifität der Erkennung.

In-situ-Erkennung: Die Methode zur Erkennung von Amplifikationsprodukten von In-situ-PCR hängt vom Design des In-situ-PCR-Protokolls ab. Direkte Methoden erkennen die amplifizierten Produkte direkt auf der Grundlage der Art der markierten Moleküle nach, Während indirekte Methoden eine Erkennung durch In-situ-Hybridisierung erfordern.

Die Anwendung der In-situ-PCR

Nachweis von exogenen Genen

• Nachweis von viralen Genen:
  • In mit Viren infizierten Zellen, Die Erkennung kann eine Herausforderung sein. Jedoch, In-situ-PCR bietet Hoffnung, diese Schwierigkeit anzugehen.
  • In-situ-PCR wurde erfolgreich angewendet, um die Rolle verschiedener Viren wie HIV zu beobachten, HPV, HSV, HBV, HCV, usw., unter Bedingungen wie AIDS, Tumoren des Fortpflanzungssystems, Hepatitis, und Leberkrebs, Aktivieren Sie die rechtzeitige Identifizierung infizierter Personen.
• Nachweis von Bakteriengenen:
  • Eine herausragende Anwendung ist der Nachweis von Mycobacterium tuberculosis. Wenn Tuberkulose -Läsionen atypisch sind, Es ist schwierig, die Bakterien unter dem Mikroskop mit speziellen Färbemethoden zu identifizieren. In-situ-PCR kann dazu beitragen, eine endgültige Diagnose zu stellen, Auch wenn das Vorhandensein von Mycobacterium tuberculosis minimal ist.
• Nachweis von importierten Genen:
  • In der Untersuchung transgener Tiere, Bestätigung der Genimportierung, sowie bei Patienten, die sich einer Gentherapie unterziehen, kann mit der In-situ-PCR überprüft werden. Daher, In-situ-PCR ist zu einer wichtigen Erkennungsmethode geworden.

Nachweis von endogenen Genen

Nachweis von abnormalen Genen:

• Mutations- und Neuanordnungserkennung:
  • In-situ-PCR kann Mutationen und Umlagerungen in Genen im Körper nachweisen.
  • Mutationen in Protoonkogenen und Tumorsuppressorgenen, sowie Umlagerungen von Immunglobulin -schweren Kettengenen, sind Beispiele für genetische Veränderungen, die unter Verwendung von In-situ-PCR nachgewiesen wurden.
• Anwendungen in der Krebsforschung und -diagnose:
  • Diese Mutationen und Umstände spielen eine entscheidende Rolle bei der Krebsentwicklung und bei der Fortschreitung.
  • In-situ-PCR bietet breite Anwendungen in der Krebsforschung und -diagnose, indem die genaue Erkennung dieser genetischen Veränderungen ermöglicht wird.
  • Es erleichtert das Verständnis molekularer Mechanismen, die Krebs zugrunde liegen, und hilft bei der Entwicklung gezielter Therapien.

Erkennung konstitutiver Gene:

• Herausforderungen der Genexpression auf niedriger Ebene:
  • Konstitutive Gene, die bei niedrigen Werten exprimiert werden.
  • In-situ-Hybridisierungstechniken sind aufgrund der begrenzten Genkopienzahlen in Körperzellen unwirksam.
• Einschränkungen der Flüssigphasen-PCR:
  • Die Flüssigkeitsphasen-PCR kann Gene niedriger Ebene amplifizieren und nachweisen, aber es fehlt die Zelltypspezifität.
  • Es kann nicht bestimmen, welcher Zelltyp das Zielgen genau enthält.
• Vorteile der In-situ-PCR:
  • In-situ-PCR überwindet diese Einschränkungen.
  • Es ermöglicht den Nachweis verschiedener menschlicher Gene, Sogar diejenigen, die auf niedrigen Werten ausgedrückt werden.
  • Die In-situ-PCR trägt zum Abschluss der menschlichen Genkarte bei.