PCR ในแหล่งกำเนิดคืออะไร? มันใช้อะไร?

ในสถานที่ พีซีอาร์, หรือปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสในแหล่งกำเนิด, เป็นเทคนิคที่ใช้ในการวิจัยทางวิทยาศาสตร์. เทคโนโลยีใหม่ ๆ ที่พัฒนาขึ้นในวิทยาศาสตร์นำมาซึ่งผลการวิจัยใหม่ ๆ, จึงขับเคลื่อนความก้าวหน้าของสาขาวิชาต่างๆ.

การพัฒนา PCR ในแหล่งกำเนิด

• ในปี 1950, การแนะนำกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนในการสังเกตการณ์ทางสัณฐานวิทยาทำให้เกิดการวิจัยเชิงลึกจากระดับเซลล์จนถึงระดับเซลล์ย่อย.
• ในปี 1960 และ 1970, การประยุกต์ใช้อิมมูโนฮิสโตเคมีและเทคนิคอิมมูโนไซโตเคมีอย่างกว้างขวางผลักดันการสังเกตจากโครงสร้าง subcellular ไปจนถึงระดับของโมเลกุลโปรตีน, อนุญาตให้มีการแปลสารที่ใช้งานจำนวนมากภายในเซลล์หรือในระดับเซลล์ย่อย, ส่งผลกระทบอย่างลึกซึ้งต่อการพัฒนาชีววิทยาการแพทย์.
• ในปี 1970, การประยุกต์ใช้เทคนิคชีววิทยาโมเลกุลอย่างกว้างขวางในสัณฐานวิทยา, พร้อมกับการเกิดขึ้นของเทคโนโลยีการผสมพันธุ์ในแหล่งกำเนิด, เปิดใช้งานการแปลลำดับ DNA หรือ RNA เฉพาะภายในเซลล์เนื้อเยื่อ, การเพิ่มระดับการสังเกตและการแปลจากโปรตีนสู่ระดับพันธุกรรม, คือโมเลกุลของกรดนิวคลีอิก. ความเข้าใจของมนุษย์ที่ลึกซึ้งยิ่งขึ้นเกี่ยวกับปรากฏการณ์ทางชีวภาพมากมายในระดับพันธุกรรม.
• ในปี 1980, พีซีอาร์ (ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส), เทคนิคที่สำคัญอย่างยิ่งในสาขาวิชาชีววิทยาโมเลกุล, โผล่ออกมา. มันถูกนำมาใช้อย่างรวดเร็วในด้านการสังเกตการณ์ทางสัณฐานวิทยา, การเปิดใช้งานการแปลและการสังเกตของ DNA หรือ RNA เฉพาะที่มีหมายเลขสำเนาต่ำหรือสำเนาเดียวภายในเซลล์. การถือกำเนิดของเทคนิคนี้มีความมุ่งมั่นที่จะนำผลการวิจัยออกมามากขึ้น, ขับเคลื่อนการศึกษาทางสัณฐานวิทยาไปข้างหน้าโดยก้าวย่างที่สำคัญ.

หลักการของ PCR ในแหล่งกำเนิด

• หลักการพื้นฐาน: PCR ในแหล่งกำเนิดรวมการขยายประสิทธิภาพสูงของ PCR กับการแปลเซลล์ของการผสมพันธุ์ในแหล่งกำเนิดเพื่อตรวจจับลำดับ DNA หรือ RNA เฉพาะภายในเซลล์เนื้อเยื่อ.
• เทคนิค PCR: ใช้ประโยชน์จาก DNA polymerase เพื่อขยายลำดับเป้าหมายเฉพาะผ่านการสูญเสียสภาพ, การหลอม, และรอบการขยาย, ส่งผลให้มีการขยายที่ละเอียดอ่อนและเฉพาะเจาะจง.
• ข้อ จำกัด ของ PCR แบบดั้งเดิม: PCR แบบดั้งเดิมดำเนินการในระยะของเหลว, ต้องการการหยุดชะงักของเซลล์และการสกัดกรดนิวคลีอิกก่อนการขยาย, ทำให้มันท้าทายที่จะสัมพันธ์กับผลลัพธ์ PCR กับสัณฐานวิทยาของเซลล์และระบุชนิดของเซลล์ที่มีลำดับเป้าหมายเฉพาะ.
• ข้อดีของ PCR ในแหล่งกำเนิด: รวมจุดแข็งของ PCR และเทคนิคการผสมพันธุ์ในแหล่งกำเนิดในขณะที่เอาชนะข้อ จำกัด ของพวกเขา.
• ขั้นตอน: ตัวอย่างเนื้อเยื่อได้รับการแก้ไขทางเคมีเพื่อรักษาสัณฐานวิทยาของเซลล์. การซึมผ่านของเซลล์และเยื่อหุ้มนิวเคลียร์ช่วยให้ส่วนประกอบ PCR เข้าสู่เซลล์หรือนิวเคลียส, ที่พวกเขาขยาย RNA หรือ DNA แก้ไขในแหล่งกำเนิด. ผลิตภัณฑ์ขยาย, โดยทั่วไปแล้วโมเลกุลขนาดใหญ่หรือโครงสร้างแบบผสมผสาน, ถูกเก็บรักษาไว้ในแหล่งกำเนิดและตรวจพบได้ง่ายโดยการผสมพันธุ์ในแหล่งกำเนิด.
• ประโยชน์: เปิดใช้งานการขยายแบบเอ็กซ์โปเนนเชียลของลำดับ DNA หรือ RNA เฉพาะภายในเซลล์, อำนวยความสะดวกในการตรวจจับของพวกเขาผ่านการผสมพันธุ์ในแหล่งกำเนิด.

ประเภทพื้นฐาน ของ PCR ในแหล่งกำเนิด

เทคนิค PCR ในแหล่งกำเนิดสามารถแบ่งออกเป็นสองประเภทหลัก: วิธีการโดยตรงและวิธีการทางอ้อม, ขึ้นอยู่กับว่านิวคลีโอไทด์หรือไพรเมอร์ที่ใช้ในปฏิกิริยาการขยายจะมีฉลาก. นอกจากนี้, มีเทคนิคการถอดความแบบย้อนกลับในแหล่งกำเนิด PCR.

วิธีการโดยตรงในการใช้เทคนิค PCR ในแหล่งกำเนิด:

• ในวิธีการโดยตรง, ผลิตภัณฑ์การขยายจะมีป้ายกำกับโดยตรงกับโมเลกุลของเครื่องหมาย, เช่น triphosphate adenosine หรือชิ้นส่วนไพรเมอร์ที่มีป้ายกำกับ. ในระหว่างการขยาย PCR ของตัวอย่าง, โมเลกุลที่ติดฉลากนั้นรวมอยู่ในผลิตภัณฑ์ที่ขยายออกไป, การเปิดใช้งานการสร้างภาพของ DNA หรือ RNA เฉพาะในตัวอย่าง (ในสถานที่).
• เครื่องหมายทั่วไปรวมถึงไอโซโทปกัมมันตรังสีเช่น 35S, ไบโอติน, และ digoxigenin. เครื่องหมายเหล่านี้’ ตำแหน่งสามารถตรวจพบได้โดยใช้วิธีการต่าง ๆ เช่น autoradiography สำหรับไอโซโทปกัมมันตรังสีหรือเคมีเนื้อเยื่อที่สัมพันธ์กัน.
• ข้อดีของวิธีการโดยตรงรวมถึงความเรียบง่าย, เวลาในการประมวลผลที่สั้นลง, และความสะดวกในการใช้งาน. อย่างไรก็ตาม, มีข้อเสียเช่นความจำเพาะที่ต่ำกว่า, โอกาสที่สูงขึ้นของผลบวกที่ผิดพลาด, และประสิทธิภาพการขยายตัวลดลง, โดยเฉพาะอย่างยิ่งในส่วนพาราฟินที่ความเสียหายของดีเอ็นเอในระหว่างการแบ่งส่วนอาจนำไปสู่ผลบวกที่ผิดพลาด.
• วิธีการทางอ้อมเทคนิค PCR ในแหล่งกำเนิด:

วิธีการทางอ้อมเทคนิค PCR ในแหล่งกำเนิด:

• ในวิธีทางอ้อม, การขยาย DNA หรือ RNA เฉพาะจะดำเนินการครั้งแรกภายในเซลล์, ตามด้วยการผสมพันธุ์ในแหล่งกำเนิดโดยใช้โพรบที่มีป้ายกำกับ, ปรับปรุงความจำเพาะอย่างมีนัยสำคัญ. ปัจจุบันเป็นเทคนิค PCR ในแหล่งกำเนิดที่ใช้กันอย่างแพร่หลายมากที่สุด.
• ไม่เหมือนวิธีการโดยตรง, ระบบปฏิกิริยาคล้ายกับ PCR ทั่วไป, ไม่มีไพรเมอร์ที่มีป้ายกำกับหรือ adenosine triphosphate ที่ใช้. จุดประสงค์คือการขยายก่อน, จากนั้นตรวจจับผลิตภัณฑ์ DNA เฉพาะที่ขยายภายในเซลล์โดยใช้เทคโนโลยีการผสมพันธุ์ในแหล่งกำเนิด. มันผสมผสานเทคนิคการผสมพันธุ์ PCR และในแหล่งกำเนิดได้อย่างมีประสิทธิภาพ, ยังเป็นที่รู้จักกันในนาม PCR ในแหล่งกำเนิดไฮบริด (ปะทะ).
• ข้อดีของวิธีการทางอ้อมรวมถึงความจำเพาะที่สูงขึ้นและประสิทธิภาพการขยาย, แต่มันเกี่ยวข้องกับขั้นตอนการปฏิบัติงานที่ซับซ้อนกว่าวิธีการโดยตรง.

เทคนิคการถอดความแบบย้อนกลับในแหล่งกำเนิด:

• PCR การถอดรหัสย้อนกลับในแหล่งกำเนิด (ในแหล่งกำเนิด rt-pcr) เป็นเทคนิคใหม่ที่ใช้เทคโนโลยี RT-PCR ของเหลวเฟสกับตัวอย่างเซลล์เนื้อเยื่อ. ไม่เหมือนกับ RT-PCR ของเหลวเฟส, ตัวอย่างเนื้อเยื่อได้รับการรักษาด้วยเอนไซม์ DNA ก่อนการถอดรหัสแบบย้อนกลับในแหล่งกำเนิด PCR เพื่อทำลาย DNA เนื้อเยื่อ, ตรวจสอบให้แน่ใจว่าเทมเพลตที่ขยายเป็น cDNA สังเคราะห์จาก mRNA, ไม่ใช่ DNA ดั้งเดิมในเซลล์. ขั้นตอนพื้นฐานอื่น ๆ คล้ายกับ RT-PCR ของเหลวเฟส.

วิธีเรียกใช้การทดสอบ PCR ในแหล่งกำเนิด?

ขั้นตอนพื้นฐานของเทคโนโลยี PCR ในแหล่งกำเนิดรวมถึงการเตรียมตัวอย่าง, การขยายในแหล่งกำเนิด (พีซีอาร์), และการตรวจจับในแหล่งกำเนิด, ตามที่ระบุไว้ด้านล่าง (โดยมุ่งเน้นไปที่ส่วนพาราฟิน):

การจัดเตรียมตัวอย่าง:

• เทคนิค PCR ในแหล่งกำเนิดสามารถนำไปใช้กับสารแขวนลอยของเซลล์ได้, รอยเปื้อนเซลล์, ส่วนแช่แข็ง, และส่วนพาราฟิน.
• เมื่อเทียบกับวิธีอื่น ๆ, PCR ในแหล่งกำเนิดให้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุดด้วยเซลล์ที่ไม่บุบสลาย, ในขณะที่ส่วนพาราฟินให้ผลลัพธ์ที่แย่ที่สุด.
• เหตุผลบางประการสำหรับประสิทธิภาพที่ไม่ดีรวมถึง:
  • ค่าการนำความร้อนที่ไม่ดีและการพาความร้อนที่ไม่สม่ำเสมอเมื่อดำเนินการ PCR บนสไลด์.
  • การดูดซับเอนไซม์ TAQ DNA ไปยังสไลด์แก้ว.
  • หลังจากการประมวลผลตัวอย่าง, เซลล์ขาดไซโตพลาสซึมหรือเยื่อหุ้มนิวเคลียร์ที่ไม่บุบสลาย, นำไปสู่การแพร่กระจายของผลิตภัณฑ์ขยายและความยากลำบากในการรักษาไว้ในแหล่งกำเนิด.
• ตัวอย่างพยาธิวิทยาส่วนใหญ่ได้รับการแก้ไขด้วยฟอร์มาลินและเก็บรักษาไว้ในพาราฟิน.
• การแก้ปัญหาทางเทคนิคที่เกี่ยวข้องกับ PCR ในแหล่งกำเนิดในส่วนพาราฟินจะมีความสำคัญอย่างมาก.

การตรึงเซลล์เนื้อเยื่อ: เซลล์เนื้อเยื่อมักจะได้รับการแก้ไขด้วย 10% ฟอร์มาลินบัฟเฟอร์หรือ 4% Paraformaldehyde เพื่อผลลัพธ์ที่ดีกว่าใน PCR ในแหล่งกำเนิด. เวลาการตรึงไม่ควรยาวมากเกินไป, โดยทั่วไป 4-6 ชั่วโมงที่ 4 ° C.

ความหนาของฝาน: ชิ้นส่วนที่หนากว่าโดยทั่วไปให้ผลลัพธ์ที่ดีกว่าใน PCR ในแหล่งกำเนิดเนื่องจากมีโครงสร้าง DNA และเมมเบรนเป้าหมายมากขึ้น, การป้องกันการแพร่กระจายของผลิตภัณฑ์ขยาย. อย่างไรก็ตาม, ชิ้นที่หนาขึ้นอาจนำไปสู่การทับซ้อนของเซลล์มากขึ้นและลดความละเอียดในการสังเกตทางสัณฐานวิทยา.

การรักษาแบบเลื่อน: เพื่อป้องกันการปลดส่วนพาราฟินในระหว่าง PCR และการผสมพันธุ์ในแหล่งกำเนิด, ควรทำการรักษาสไลด์เพื่อป้องกันการปลด. วิธีการทั่วไปรวมถึงการเคลือบด้วยการรักษาด้วยโพลี-ไลซีนหรือการทำ silanization, ซึ่งโดยทั่วไปป้องกันการปลดเนื้อเยื่อ.

การย่อยอาหารโปรตีเอส:

การขยายในแหล่งกำเนิด (พีซีอาร์): การขยายในแหล่งกำเนิดเกี่ยวข้องกับการทำปฏิกิริยา PCR ในตัวอย่างเซลล์เนื้อเยื่อ, ด้วยหลักการพื้นฐานที่เหมือนกับ PCR ของเหลวเฟส. ไพรเมอร์ที่ใช้ใน PCR โดยทั่วไป 15-30bp, และชิ้นส่วนที่ขยายออกไปประมาณ 100-1000bp.

ระบบปฏิกิริยา:

• ระบบปฏิกิริยาสำหรับ PCR ในแหล่งกำเนิดนั้นคล้ายกับของ PCR ของเหลวแบบดั้งเดิม.
• ความเข้มข้นของไพรเมอร์ที่สูงขึ้น, TaqDNA polymerase, และ Mg2+ ได้รับการแนะนำเพื่อผลลัพธ์การขยายที่ดีขึ้นของชิ้นเนื้อเยื่อคงที่เมื่อเทียบกับระบบ PCR ของเหลวเฟสของเหลว.
• วัวเซรั่มอัลบูมิน (BSA) ควรเพิ่มลงในระบบปฏิกิริยาเพื่อป้องกันไม่ให้พอลิเมอเรส TAQ DNA จากการจับกับสไลด์แก้วและลดประสิทธิภาพการขยาย.

การปั่นจักรยานความร้อน:

• การปั่นจักรยานความร้อนสำหรับ PCR ในแหล่งกำเนิดสามารถทำได้ในเครื่องปั่นความร้อนแบบพิเศษหรือเครื่องปั่นความร้อน PCR ปกติ.
• แต่ละขั้นตอนในการขี่จักรยานความร้อนของ PCR ในแหล่งกำเนิดอาจยาวกว่าใน PCR ทั่วไปเล็กน้อยเพื่อให้แน่ใจว่ามีการขยายที่เพียงพอ.
• สามารถใช้วิธีการเริ่มต้นร้อนเพื่อลดการสูญเสียของระบบปฏิกิริยาในระหว่างการขี่จักรยานความร้อน.

ซักผ้า:

• หลังจากการขยายในแหล่งกำเนิด, ตัวอย่างควรได้รับการซักเพื่อลบผลิตภัณฑ์ขยายที่กระจายเซลล์ภายนอก.
• การซักที่ไม่เพียงพออาจนำไปสู่การสร้างภาพของผลิตภัณฑ์ขยายในระหว่างการตรวจจับ, ส่งผลให้เกิดพื้นหลังที่มืดมากเกินไปหรือผลลัพธ์ที่ผิดพลาด.
• การซักที่มากเกินไปอาจส่งผลให้การกำจัดผลิตภัณฑ์ขยายภายในเซลล์, อ่อนลงหรือสูญเสียสัญญาณเชิงบวก.

การตรึง: ผู้เขียนบางคนรายงานการใช้งาน 4% พาราฟอร์มัลดีไฮด์สำหรับ 2 ชั่วโมงหรือ 2% กลูตารัลดีไฮด์สำหรับ 5 นาทีสำหรับหลังการตรึงหลังการขยายเพื่อให้แน่ใจว่าผลิตภัณฑ์ที่ขยายได้จะถูกเก็บรักษาไว้อย่างดีในเซลล์ในระหว่างการตรวจจับ, ดังนั้นการปรับปรุงความไวและความจำเพาะของการตรวจจับ.

การตรวจจับในแหล่งกำเนิด: วิธีการตรวจจับการขยายผลิตภัณฑ์ของ PCR ในแหล่งกำเนิดขึ้นอยู่กับการออกแบบโปรโตคอล PCR ในแหล่งกำเนิด. วิธีการโดยตรงตรวจจับโดยตรงผลิตภัณฑ์ที่ขยายตามลักษณะของโมเลกุลที่มีป้ายกำกับ, ในขณะที่วิธีการทางอ้อมต้องการการตรวจจับผ่านการผสมพันธุ์ในแหล่งกำเนิด.

แอปพลิเคชันของ PCR ในแหล่งกำเนิด

การตรวจหายีนภายนอก

• การตรวจหายีนไวรัส:
  • ในเซลล์ที่ติดเชื้อไวรัส, การตรวจจับอาจเป็นสิ่งที่ท้าทาย. อย่างไรก็ตาม, PCR ในแหล่งกำเนิดเสนอความหวังในการจัดการกับปัญหานี้.
  • PCR ในแหล่งกำเนิดถูกนำไปใช้อย่างประสบความสำเร็จในการสังเกตบทบาทของไวรัสต่าง ๆ เช่นเอชไอวี, HPV, HSV, HBV, HCV, ฯลฯ, ในเงื่อนไขเช่นเอดส์, เนื้องอกระบบสืบพันธุ์, โรคตับอักเสบ, และมะเร็งตับ, เปิดใช้งานการระบุผู้ติดเชื้อในเวลาที่เหมาะสม.
• การตรวจหายีนแบคทีเรีย:
  • แอปพลิเคชั่นที่โดดเด่นอยู่ในการตรวจหาวัณโรคมัยโคแบคทีเรียม. เมื่อแผลวัณโรคผิดปกติ, การระบุแบคทีเรียภายใต้กล้องจุลทรรศน์เป็นเรื่องยากโดยใช้วิธีการย้อมสีพิเศษ. PCR ในแหล่งกำเนิดสามารถช่วยในการวินิจฉัยที่ชัดเจน, แม้ว่าการปรากฏตัวของวัณโรค mycobacterium จะน้อยที่สุด.
• การตรวจจับยีนที่นำเข้า:
  • ในการศึกษาสัตว์ดัดแปลงพันธุกรรม, การยืนยันการนำเข้ายีน, เช่นเดียวกับในผู้ป่วยที่ได้รับการบำบัดด้วยยีน, สามารถตรวจสอบได้โดยใช้ PCR ในแหล่งกำเนิด. ดังนั้น, PCR ในแหล่งกำเนิดได้กลายเป็นวิธีการตรวจจับที่สำคัญ.

การตรวจหายีนภายนอก

การตรวจหายีนที่ผิดปกติ:

• การกลายพันธุ์และการตรวจจับการจัดเรียงใหม่:
  • PCR ในแหล่งกำเนิดมีความสามารถในการตรวจจับการกลายพันธุ์และการจัดเรียงใหม่ในยีนภายในร่างกาย.
  • การกลายพันธุ์ในยีนโปรโต-แอนโกจีเนสและยีนยับยั้งเนื้องอก, เช่นเดียวกับการจัดเรียงยีนโซ่หนักอิมมูโนโกลบูลินใหม่, เป็นตัวอย่างของการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมที่ตรวจพบโดยใช้ PCR ในแหล่งกำเนิด.
• การประยุกต์ใช้ในการวิจัยโรคมะเร็งและการวินิจฉัย:
  • การกลายพันธุ์และการจัดเรียงใหม่เหล่านี้มีบทบาทสำคัญในการพัฒนามะเร็งและความก้าวหน้า.
  • ในแหล่งกำเนิด PCR เสนอการใช้งานที่กว้างขวางในการวิจัยและการวินิจฉัยโรคมะเร็งโดยการเปิดใช้งานการตรวจจับการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมเหล่านี้อย่างแม่นยำ.
  • ช่วยอำนวยความสะดวกในการทำความเข้าใจกลไกระดับโมเลกุลที่เป็นโรคมะเร็งและโรคเอดส์ในการพัฒนาของการรักษาเป้าหมาย.

การตรวจหายีนที่เป็นส่วนประกอบ:

• ความท้าทายของการแสดงออกของยีนระดับต่ำ:
  • ยีนที่เป็นส่วนประกอบแสดงในระดับต่ำก่อให้เกิดความท้าทายสำหรับวิธีการตรวจจับ.
  • เทคนิคการผสมพันธุ์ในแหล่งกำเนิดนั้นไม่ได้ผลเนื่องจากจำนวนการคัดลอกยีนที่ จำกัด ในเซลล์ร่างกาย.
• ข้อ จำกัด ของ PCR ของเหลวเฟส:
  • PCR ของเหลวเฟสสามารถขยายและตรวจจับยีนระดับต่ำได้ แต่ขาดความจำเพาะของประเภทเซลล์.
  • ไม่สามารถกำหนดชนิดของเซลล์ที่มียีนเป้าหมายได้อย่างถูกต้อง.
• ข้อดีของ PCR ในแหล่งกำเนิด:
  • PCR ในแหล่งกำเนิดเอาชนะข้อ จำกัด เหล่านี้.
  • ช่วยให้สามารถตรวจจับยีนมนุษย์ต่าง ๆ ได้, แม้แต่ผู้ที่แสดงในระดับต่ำ.
  • PCR ในแหล่งกำเนิดมีส่วนช่วยในการสร้างแผนที่ยีนของมนุษย์ให้เสร็จสมบูรณ์โดยให้การแปลของยีนที่แม่นยำภายในเซลล์เฉพาะ.