¿Qué es PCR in situ?? ¿Para qué se usa??

En el sitio PCR, o reacción en cadena de polimerasa in situ, es una técnica utilizada en la investigación científica. Cada nueva tecnología desarrollada en la ciencia presenta una serie de nuevos hallazgos de investigación., conduciendo así el avance de varias disciplinas.

El desarrollo de PCR in situ

• En la década de 1950, La introducción de la microscopía electrónica en la observación morfológica provocó una investigación en profundidad desde el nivel celular hasta el nivel subcelular.
• En las décadas de 1960 y 1970, La aplicación generalizada de las técnicas de inmunohistoquímica e inmunocitoquímica empujó la observación de estructuras subcelulares al nivel de moléculas de proteínas, permitiendo la localización de numerosas sustancias activas dentro de las células o a nivel subcelular, afectando profundamente el desarrollo de la biología médica.
• En la década de 1970, La extensa aplicación de técnicas de biología molecular en morfología, junto con la aparición de la tecnología de hibridación in situ, permitió la localización de secuencias específicas de ADN o ARN dentro de las células de tejido, Aumento del nivel de observación y localización de proteínas al nivel genético, a saber, moléculas de ácido nucleico. Esto profundizó la comprensión humana de muchos fenómenos biológicos a nivel genético.
• En la década de 1980, PCR (reacción en cadena de la polimerasa), una técnica robusamente vital en el campo de la biología molecular, surgido. Se introdujo rápidamente en el campo de la observación morfológica., habilitar la localización y observación de ADN o ARN específico con bajos números de copias o copias individuales dentro de las celdas. El advenimiento de esta técnica seguramente presentará más hallazgos de investigación., propulsar los estudios morfológicos hacia adelante por un paso significativo.

Los principios de la PCR in situ

• Principio básico: La PCR in situ combina la amplificación de alta eficiencia de PCR con la localización celular de la hibridación in situ para detectar secuencias específicas de ADN o ARN dentro de las células de tejido.
• Técnica de PCR: Utiliza la ADN polimerasa para amplificar secuencias objetivo específicas a través de la desnaturalización, recocido, y ciclos de extensión, dando como resultado una amplificación altamente sensible y específica.
• Limitaciones de la PCR tradicional: La PCR tradicional se realiza en una fase líquida, Requerir interrupción celular y extracción de ácido nucleico antes de la amplificación, Haciendo que sea difícil correlacionar los resultados de la PCR con la morfología celular e identificar tipos de células que contienen secuencias objetivo específicas.
• Ventajas de PCR in situ: Combina las fortalezas de la PCR y las técnicas de hibridación in situ mientras superan sus respectivas limitaciones.
• Procedimiento: Las muestras de tejido se fijan químicamente para mantener la morfología celular. La permeabilidad de las membranas celulares y nucleares permite que los componentes de PCR ingresen a las células o núcleos, donde amplifican el ARN o el ADN fijado in situ. Productos amplificados, típicamente moléculas o estructuras entretejidas, se retienen in situ y se detectan fácilmente por hibridación in situ.
• Beneficios: Habilita la amplificación exponencial de secuencias específicas de ADN o ARN dentro de las células, Facilitar su detección a través de la hibridación in situ.

Tipos básicos de PCR in situ

Las técnicas de PCR in situ se pueden clasificar en dos tipos principales: método directo y método indirecto, Basado en si los nucleótidos o cebadores trifosfatos utilizados en la reacción de amplificación están marcados. Además, Existe la técnica de PCR in situ de transcripción inversa.

Técnica de PCR de método directo in situ:

• En el método directo, Los productos de amplificación se etiquetan directamente con moléculas marcadoras, tales como fragmentos de adenosina trifosfato o imprimación etiquetados. Durante la amplificación por PCR del espécimen, Las moléculas etiquetadas se incorporan a los productos amplificados, habilitar la visualización de ADN o ARN específico en la muestra (en el sitio).
• Los marcadores comunes incluyen isótopos radiactivos como 35s, biotina, y digoxigenina. Estos marcadores’ Las ubicaciones se pueden detectar utilizando métodos tales como autorradiografía para isótopos radiactivos o química del tejido de afinidad e inmunohistoquímica para biotina y digoxigenina.
• Las ventajas del método directo incluyen simplicidad, tiempo de procesamiento más corto, y facilidad de operación. Sin embargo, tiene desventajas como la menor especificidad, mayor probabilidad de falsos positivos, y menor eficiencia de amplificación, Especialmente en secciones de parafina donde el daño del ADN durante el seccionamiento puede conducir a falsos positivos.
• Método indirecto Técnica de PCR in situ:

Método indirecto Técnica de PCR in situ:

• En el método indirecto, La amplificación específica de ADN o ARN se realiza primero dentro de las células, seguido de la hibridación in situ utilizando sondas marcadas, mejorando significativamente la especificidad. Actualmente es la técnica de PCR in situ más utilizada.
• A diferencia del método directo, El sistema de reacción es similar a la PCR convencional, sin cebadores marcados o adenosina trifosfato utilizada. El propósito es amplificar primero, Luego detecte los productos de ADN específicos amplificados dentro de las células utilizando tecnología de hibridación in situ. Combina efectivamente las técnicas de hibridación de PCR e in situ, También conocido como hibridación in situ de PCR (Bateador).
• Las ventajas del método indirecto incluyen una mayor especificidad y eficiencia de amplificación, pero implica pasos operativos más complejos que el método directo.

Técnica de PCR de transcripción inversa in situ:

• PCR de transcripción inversa in situ (RT-PCR in situ) es una nueva técnica que aplica la tecnología RT-PCR de fase líquida a las muestras de células de tejido. A diferencia de la RT-PCR de fase líquida, Las muestras de tejido se tratan con enzimas de ADN antes de la PCR de transcripción inversa in situ para destruir el ADN del tejido, Asegurar que la plantilla amplificada se sintetice de ADNc de ARNm, no el ADN original en las células. Otros pasos básicos son similares a la RT-PCR de fase líquida.

Cómo ejecutar la prueba de PCR in situ?

Los pasos básicos de la tecnología de PCR in situ incluyen la preparación de la muestra, amplificación in situ (PCR), y detección in situ, Como se describe a continuación (con un enfoque en las secciones de parafina):

Preparación de la muestra:

• Las técnicas de PCR in situ se pueden aplicar a las suspensiones celulares, manchas celulares, secciones congeladas, y secciones de parafina.
• En comparación con otros métodos, La PCR in situ produce los mejores resultados con células intactas suspendidas, mientras que las secciones de parafina producen los resultados más pobres.
• Algunas razones para el bajo rendimiento incluyen:
  • Mala conductividad térmica y convección de calor desigual al realizar PCR en toboganes.
  • Adsorción de enzimas de ADN taq a diapositivas de vidrio.
  • Después del procesamiento de la muestra, Las células carecen de citoplasma intacto o membranas nucleares, conduciendo a la difusión de productos de amplificación y dificultad para retenerlos in situ.
• La mayoría de las muestras de patología se fijan con formalina y se conservan en parafina.
• Resolver problemas técnicos relacionados con la PCR in situ en secciones de parafina sería muy significativo.

Fijación de células de tejido: Las células de los tejidos generalmente se fijan con 10% formalina amortiguada o 4% paraformaldehído para obtener mejores resultados en PCR in situ. El tiempo de fijación no debe ser excesivamente largo, típicamente 4-6 horas a 4 ° C.

Espesor de la rebanada: Las rebanadas más gruesas generalmente producen mejores resultados en PCR in situ porque contienen más estructuras de ADN y membrana objetivo, Prevención de la difusión de productos de amplificación. Sin embargo, Las rodajas más gruesas pueden conducir a una mayor superposición de células y una resolución disminuida en la observación morfológica.

Tratamiento de diapositivas: Para evitar el desprendimiento de secciones de parafina durante la PCR e hibridación in situ, Las diapositivas deben tratarse para prevenir el desprendimiento. Los métodos comunes incluyen el recubrimiento con el tratamiento con poli-lisina o silanización, que generalmente evitan el desprendimiento de tejido.

Digestión de proteasa:

Amplificación in situ (PCR): La amplificación in situ implica realizar reacciones de PCR en muestras de células de tejido, con el principio básico es el mismo que el de la PCR de fase líquida. Los cebadores utilizados en PCR son generalmente de 15-30 pb, y los fragmentos amplificados son de alrededor de 100-1000bp.

Sistema de reacción:

• El sistema de reacción para PCR in situ es similar al de la PCR de fase líquida convencional.
• Concentraciones más altas de cebadores, Taqdna polimerasa, y se sugieren MG2+ para obtener mejores resultados de amplificación en rodajas de tejido fijo en comparación con los sistemas de PCR de fase líquida.
• Albúmina de suero bovino (BSA) debe agregarse al sistema de reacción para evitar que la ADN polimerasa de Taq se una a los portaobjetos de vidrio y reduzca la eficiencia de amplificación.

Ciclismo térmico:

• El ciclo térmico para PCR in situ se puede hacer en un ciclador térmico especializado o un ciclador térmico de PCR regular.
• Cada paso en el ciclo térmico de la PCR in situ puede ser ligeramente más largo que en la PCR convencional para garantizar una amplificación adecuada.
• Se puede emplear un método de inicio en caliente para minimizar la pérdida del sistema de reacción durante el ciclo térmico.

Lavado:

• Después de la amplificación in situ, Las muestras deben someterse a lavado para eliminar productos de amplificación que han difundido las células externas.
• El lavado inadecuado puede conducir a la visualización de productos de amplificación durante la detección, resultando en fondos excesivamente oscuros o resultados falsos positivos.
• El lavado excesivo también puede dar lugar a la eliminación de productos amplificados dentro de las células, debilitando o perdiendo señales positivas.

Post-fijación: Algunos autores han informado que usan 4% paraformaldehído para 2 horas o 2% glutaraldehído para 5 Actas para la fijación posterior después de la amplificación para garantizar que los productos amplificados estén bien retenidos en las células durante la detección, mejorando así la sensibilidad y la especificidad de la detección.

Detección in situ: El método para detectar productos de amplificación de PCR in situ depende del diseño del protocolo de PCR in situ. Los métodos directos detectan directamente los productos amplificados basados en la naturaleza de las moléculas marcadas, Mientras que los métodos indirectos requieren la detección a través de la hibridación in situ.

La aplicación de PCR in situ

Detección de genes exógenos

• Detección de genes virales:
  • En células infectadas con virus, La detección puede ser desafiante. Sin embargo, La PCR in situ ofrece esperanza para abordar esta dificultad.
  • La PCR in situ se ha aplicado con éxito para observar el papel de varios virus como el VIH, VPH, HSV, VHB, VHC, etc., en condiciones como el sida, Tumores del sistema reproductivo, hepatitis, y cáncer de hígado, permitiendo la identificación oportuna de individuos infectados.
• Detección de genes bacterianos:
  • Una aplicación prominente está en la detección de Mycobacterium tuberculosis. Cuando las lesiones de tuberculosis son atípicas, Es difícil identificar las bacterias bajo el microscopio utilizando métodos de tinción especiales. La PCR in situ puede ayudar a hacer un diagnóstico definitivo, Incluso cuando la presencia de Mycobacterium tuberculosis es mínima.
• Detección de genes importados:
  • En el estudio de animales transgénicos, Confirmación de la importación de genes, así como en pacientes sometidos a terapia génica, se puede verificar usando PCR in situ. De este modo, La PCR in situ se ha convertido en un método de detección importante.

Detección de genes endógenos

Detección de genes anormales:

• Detección de mutación y reordenamiento:
  • La PCR in situ es capaz de detectar mutaciones y reordenamientos en genes dentro del cuerpo.
  • Mutaciones en proto-oncogenes y genes supresores de tumores, así como reordenamientos de genes de cadena pesada de inmunoglobulina, son ejemplos de alteraciones genéticas detectadas utilizando PCR in situ.
• Aplicaciones en investigación y diagnóstico del cáncer:
  • Estas mutaciones y reordenamientos juegan un papel crucial en el desarrollo del cáncer y la progresión.
  • La PCR in situ ofrece aplicaciones amplias en la investigación y el diagnóstico del cáncer al permitir la detección precisa de estas alteraciones genéticas.
  • Facilita la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes al cáncer y ayuda en el desarrollo de terapias dirigidas.

Detección de genes constitutivos:

• Desafíos de la expresión génica de bajo nivel:
  • Los genes constitutivos expresados a niveles bajos plantean desafíos para los métodos de detección.
  • Las técnicas de hibridación in situ son ineficaces debido a los números limitados de copias genéticas en las células del cuerpo.
• Limitaciones de la PCR de fase líquida:
  • La PCR de fase líquida puede amplificar y detectar genes de bajo nivel, pero carece de especificidad de tipo celular.
  • No puede determinar qué tipo de célula contiene el gen objetivo con precisión.
• Ventajas de PCR in situ:
  • La PCR in situ supera estas limitaciones.
  • Permite la detección de varios genes humanos, incluso aquellos expresados a niveles bajos.
  • La PCR in situ contribuye a la finalización del mapa de genes humanos al proporcionar una localización de genes precisa dentro de tipos de células específicas.