脫氧核糖核苷酸三磷酸鹽 (dNTP) 是重要組成部分 聚合酶鍊式反應 (聚合酶鍊式反應). DNTP充當允許DNA複製的構建塊. 期間 聚合酶鍊式反應, DNTP啟用目標DNA序列的擴增. 了解什麼是DNTP，它們的功能是欣賞PCR的關鍵.
DNTP代表什麼?
DNTP代表脫氧核糖核苷酸三磷酸. 脫氧核糖核苷酸是構成DNA的單體. 每個脫氧核糖核苷酸都由:
- 氮基鹼: 腺嘌呤 (A), 胸腺嘧啶 (時間), 胞嘧啶 (C), 或鳥嘌呤 (G).
- 脫氧核糖糖分子.
- 三磷酸組.
'deoxy’ 前綴表示糖成分是脫氧核糖而不是核糖. 脫氧核糖在2上缺乏氧原子′ 碳.
三磷酸是指連接到5的三種磷酸鹽′ 糖上的碳. 具有三個磷酸組使DNTP高能分子.
多少種類型的DNTP?
有四個不同的DNTP, 每個DNA鹼基一個:
- dATP – 脫氧腺苷三磷酸
- dTTP –脫氧胸苷三磷酸
- dCTP –脫氧三磷酸
- dGTP –三磷酸脫氧鳥苷
這四個DNTP是合成新DNA鏈所需的基本構建塊.
生物學中的dntps是什麼?
在生物學中, DNTP在DNA複製和PCR中具有中心作用:
DNA複製
在細胞內的DNA複製期間, DNTP合成後將其納入新的DNA鏈中. 雙鏈的DNA螺旋螺旋放開並分成兩條單鏈. 每條鏈充當要製造新互補鏈的模板.
DNA聚合酶添加了與模板鏈互補的DNTP, 通過基礎配對綁定. 基地配對, DNTP的糖磷酸骨架連接在一起.
這一直持續到兩個新鏈都是原始DNA分子的完整副本. DNTP提供了構造新DNA鏈的必要組件.
聚合酶鍊式反應
在PCR中, DNTP的功能與DNA複製期間相同. PCR模擬測試管中的細胞DNA複製. 使用加熱和冷卻的循環反复複製靶DNA序列.
在每個週期中, DNTP是通過DNA聚合酶添加的，以構建與分離模板鏈互補的新鏈. 這會呈指數級擴增目標區域. DNTP允許快速合成數十億個DNA段.
如果沒有DNTP來聚合新的DNA鏈，則無法進行PCR.
DNTP如何在PCR中起作用?
DNTP是一種必不可少的試劑，可實現PCR擴增. 這是DNTP在PCR的每個步驟中的功能的概述:
變性
在初始變性步驟中, 雙鏈DNA加熱至94-98°C. 互補鏈之間的氫鍵破裂, 產生兩個單鏈DNA分子.
退火
將反應溫度降低至50-65°C以允許底漆退火. 向前和反向引物與目標DNA區域的互補序列結合.
擴展/伸長
在此步驟中, DNA聚合酶將DNTP添加到引物, 合成與模板鏈互補的新鏈. 溫度升至72°C, 理想溫度 Taq聚合酶 酶活性.
TAQ聚合酶在DNTP中帶來與裸露的模板鹼基搭配的. 隨著每個DNTP的添加, 它與生長的DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵.
一直持續到完整的互補序列形成. 結果是兩個新的雙鏈DNA拷貝，包含目標區域.
重複
熱循環重複 – 加熱以分離鏈, 冷卻底漆退火, 和聚合酶介導的延伸延伸.
每個週期都會加倍DNA副本的數量. 後 30-40 週期, 製作了數百萬個目標的副本.
在每個擴展階段中添加的DNTPS實現指數擴增. 沒有DNTP, 無法合成新的DNA鏈.
如果將DNTP排除在PCR之外，會發生什麼?
DNTP是必不可少的，需要PCR. 如果未將DNTP添加到PCR主混合物中, 反應將失敗.
沒有DNTP, TAQ聚合酶沒有核苷酸可以添加到引物. 所以, 不可能發生新的DNA鏈的伸長. 靶DNA根本不會放大.
遺漏dntps意味著PCR將行不通, 時期. 只有底漆和模板DNA將保留而不會放大.
缺乏DNTP的對照反應可用於確認DNA合成取決於DNTP. 但通常, DNTP的完全遺漏是自動失敗的PCR實驗.
為什麼在DNA測序中使用DDNTP?
在DNA測序反應中, 略微修飾的脫氧核苷酸稱為二乙氧基核苷酸 (DDNTP) 使用. DDNTP的不同是在3上包含氫原子′ 碳而不是羥基.
這個3′ 氫阻止形成下一個磷酸酯鍵. 當通過DNA聚合酶合併DDNTP時, 鏈擴展已終止.
通過使用DNTP和DDNTP的比率, 隨機終止發生, 產生不同長度的DNA片段. 然後可以按大小分開以重建原始序列.
DDNTP允許通過突然停止在特定鹼基的合成來測序DNA. 與正常的DNTP相比, DDNTPs缺少3′ 羥基需要繼續鏈伸長.
PCR中典型的DNTP濃度是多少?
PCR中的標準DNTP濃度通常為 200 每個DNTP的μm. 這提供了DNTP與DNA模板的最佳比率以有效擴增.
太低DNTP水平會導致非特異性擴增和產量不足. 太高可以降低準確性並增加非特異性產品.
200 每dNTPμm, 總共為 800 μmDNTP, 適用於大多數PCR應用. 如果需要，可以使用或多或少地使用反應.
對於長PCR, 較高的DNTP濃度 (500-1000 μm) 可以提高擴增較長DNA靶標的產量.
重要的是要使所有四個dntps保持平等濃度. 不平衡的比率會阻礙反應.
結論
DNTP是允許發生PCR擴增的核苷酸構件. 這些組件包括Datp, dTTP, dCTP, 和DGTP.
在每個PCR週期中, TAQ聚合酶將DNTP納入了與模板鏈互補的新DNA鏈中. 這可以使目標DNA區域的指數加倍.
DNTP是PCR的重要試劑. 沒有DNTP, DNA聚合酶無法合成目標序列的新副本. 放大完全取決於所有四個DNTP的存在.
了解DNTP的作用有助於我們欣賞PCR在幾個小時內如何設法生產數十億個DNA片段. 通過提供DNA複製的基本基板, DNTP位於這種必不可少的分子生物學技術的核心.
