deoxyribonucleotide triphosphates (dNTP) เป็นองค์ประกอบสำคัญของ ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (พีซีอาร์). DNTP ทำหน้าที่เป็นหน่วยการสร้างที่อนุญาตให้เกิดการจำลองแบบ DNA. ในระหว่าง พีซีอาร์, DNTPS เปิดใช้งานการขยายลำดับดีเอ็นเอเป้าหมาย. ทำความเข้าใจว่า DNTPS คืออะไรและฟังก์ชั่นของพวกเขาคือกุญแจสำคัญในการชื่นชม PCR.
DNTP หมายถึงอะไร?
DNTP ย่อมาจาก deoxyribonucleotide triphosphate. Deoxyribonucleotides เป็นโมโนเมอร์ที่แต่งหน้า DNA. แต่ละ deoxyribonucleotide ประกอบด้วย:
- ฐานไนโตรเจน: adenine (ก), ไทมีน (ต), cytosine (ค), หรือ guanine (ช).
- โมเลกุลน้ำตาล deoxyribose.
- กลุ่ม Triphosphate.
‘deoxy’ คำนำหน้าบ่งชี้ว่าส่วนประกอบน้ำตาลเป็น deoxyribose มากกว่า ribose. Deoxyribose ขาดอะตอมออกซิเจนใน 2′ คาร์บอน.
Triphosphate หมายถึงฟอสเฟตทั้งสามที่ติดอยู่กับ 5′ คาร์บอนบนน้ำตาล. การมีสามกลุ่มฟอสเฟตทำให้โมเลกุลพลังงานสูง DNTPS.
dntps กี่ประเภท?
มีสี่ dntps ที่แตกต่างกัน, หนึ่งสำหรับแต่ละฐาน DNA:
- ดีเอทีพี – deoxyadenosine triphosphate
- ดีทีพี –deoxythymidine triphosphate
- ดีซีทีพี –deoxycytidine triphosphate
- ดีจีทีพี –deoxyguanosine triphosphate
DNTP ทั้งสี่นี้เป็นหน่วยการสร้างพื้นฐานที่จำเป็นสำหรับการสังเคราะห์เส้นดีเอ็นเอใหม่.
dntps ในชีววิทยาคืออะไร?
ในชีววิทยา, DNTPs มีบทบาทสำคัญในการจำลองดีเอ็นเอและ PCR:
การจำลองดีเอ็นเอ
ในระหว่างการจำลองดีเอ็นเอภายในเซลล์, DNTPs ถูกรวมเข้ากับเส้นดีเอ็นเอใหม่เนื่องจากถูกสังเคราะห์. Helix DNA สองเส้นที่มีเกลียวผ่อนคลายและแยกออกเป็นสองเส้นเดี่ยว. แต่ละเส้นทำหน้าที่เป็นเทมเพลตสำหรับการเสริมสัดใหม่.
DNA polymerase เพิ่ม DNTPs ที่เสริมให้กับสายเทมเพลต, ผูกพันผ่านการจับคู่ฐาน. ขณะที่ฐานจับคู่, แบ็คโบนน้ำตาล-ฟอสเฟตของ DNTPs เชื่อมโยงเข้าด้วยกัน.
สิ่งนี้จะดำเนินต่อไปจนกว่าทั้งสองสายใหม่จะเป็นสำเนาของโมเลกุล DNA ดั้งเดิมที่สมบูรณ์. DNTPs จัดเตรียมส่วนประกอบที่จำเป็นในการสร้างเส้นดีเอ็นเอใหม่.
ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส
ใน PCR, DNTPS ทำหน้าที่เดียวกันกับระหว่างการจำลองดีเอ็นเอ. PCR เลียนแบบการจำลองแบบ DNA ของเซลล์ในหลอดทดสอบ. ลำดับดีเอ็นเอเป้าหมายถูกคัดลอกซ้ำ ๆ โดยใช้วัฏจักรของการทำความร้อนและความเย็น.
ในแต่ละรอบ, DNTPs จะถูกเพิ่มโดย DNA polymerase เพื่อสร้างสายใหม่ที่สมบูรณ์เข้ากับสายเทมเพลตที่แยกจากกัน. สิ่งนี้จะขยายภูมิภาคเป้าหมายแบบทวีคูณ. DNTPs อนุญาตให้มีการสังเคราะห์สำเนาของส่วน DNA หลายพันล้านชุด.
PCR ไม่สามารถดำเนินการต่อไปได้หากไม่มี DNTPs เพื่อโพลีเมอร์ดีเอ็นเอใหม่.
DNTPs ทำงานอย่างไรใน PCR?
DNTPs เป็นรีเอเจนต์ที่จำเป็นที่ช่วยให้การขยาย PCR. นี่คือภาพรวมของการทำงานของ DNTPS ในแต่ละขั้นตอนของ PCR:
การเสียสภาพ
ในขั้นตอนการสูญเสียสภาพเริ่มต้น, ดีเอ็นเอที่มีเกลียวสองเส้นสูงถึง 94-98 ° C. พันธะไฮโดรเจนระหว่างเส้นเสริมจะแตกสลาย, ให้โมเลกุลดีเอ็นเอเดี่ยวสองตัว.
การหลอม
อุณหภูมิปฏิกิริยาลดลงเหลือ 50-65 ° C เพื่อให้การหลอมไพรเมอร์. ส่งต่อและย้อนกลับไพรเมอร์ผูกกับลำดับเสริมขนาบข้างภูมิภาคดีเอ็นเอเป้าหมาย.
การขยาย/การยืดตัว
ในขั้นตอนนี้, DNA polymerase เพิ่ม dntps ลงในไพรเมอร์, การสังเคราะห์เส้นใหม่เสริมเข้ากับสายเทมเพลต. อุณหภูมิเพิ่มขึ้นเป็น 72 ° C, อุณหภูมิในอุดมคติสำหรับ แท็คโพลีเมอเรส กิจกรรมของเอนไซม์.
TAQ polymerase นำ DNTPs มาไว้ที่คู่ฐานด้วยฐานเทมเพลตที่เปิดเผย. เมื่อเพิ่ม DNTP แต่ละรายการ, พันธะฟอสโฟดีสเตอร์เกิดขึ้นระหว่างมันกับเส้นดีเอ็นเอที่กำลังเติบโต.
สิ่งนี้จะดำเนินต่อไปจนกว่าจะมีการสร้างลำดับเสริมที่สมบูรณ์. ผลที่ได้คือสำเนาดีเอ็นเอคู่ใหม่สองชุดที่มีภูมิภาคเป้าหมาย.
การทำซ้ำ
การปั่นจักรยานด้วยความร้อนซ้ำ – ความร้อนเพื่อแยกเส้น, ระบายความร้อนสำหรับการหลอมไพรเมอร์, และส่วนขยายที่ใช้สื่อกลางโพลีเมอเรสโดยใช้ DNTPS.
แต่ละรอบเพิ่มจำนวนสำเนา DNA เป็นสองเท่า. หลังจาก 30-40 รอบ, มีการสร้างสำเนาหลายล้านชุด.
DNTPs ที่เพิ่มในแต่ละเฟสส่วนขยายเปิดใช้งานการขยายแบบเอ็กซ์โปเนนเชียล. ไม่มี dntps, ไม่สามารถสังเคราะห์ DNA แบบใหม่ได้.
จะเกิดอะไรขึ้นถ้า dntps ถูกทิ้งไว้จาก PCR?
DNTPs เป็นสิ่งจำเป็นและจำเป็นสำหรับ PCR. หาก DNTPS ไม่ได้เพิ่มลงใน PCR Master Mix, ปฏิกิริยาจะล้มเหลว.
ไม่มี dntps, TAQ polymerase ไม่มีนิวคลีโอไทด์ที่จะเพิ่มลงในไพรเมอร์. ดังนั้น, การยืดตัวของเส้นดีเอ็นเอใหม่ไม่สามารถเกิดขึ้นได้. DNA เป้าหมายจะไม่ถูกขยายเลย.
ออกจาก dntps หมายความว่า PCR จะไม่ทำงาน, ระยะเวลา. เฉพาะไพรเมอร์และเทมเพลต DNA เท่านั้นที่จะยังคงไม่มีการขยาย.
ปฏิกิริยาการควบคุมที่ขาด DNTPs มีประโยชน์ในการยืนยันว่าการสังเคราะห์ DNA ขึ้นอยู่กับ DNTPS. แต่โดยปกติ, การละเว้น DNTPS อย่างสมบูรณ์เป็นการทดลอง PCR ที่ล้มเหลวโดยอัตโนมัติ.
เหตุใด DDNTPS จึงใช้ในการจัดลำดับดีเอ็นเอ?
ในปฏิกิริยาการจัดลำดับดีเอ็นเอ, deoxynucleotides ที่ได้รับการดัดแปลงเล็กน้อยเรียกว่า dideoxynucleotides (ddntps) ใช้. DDNTPS แตกต่างกันโดยมีอะตอมไฮโดรเจนบน 3′ คาร์บอนมากกว่ากลุ่มไฮดรอกซิล.
3 นี้′ ไฮโดรเจนป้องกันการก่อตัวของพันธะฟอสโฟดีสเตอร์ถัดไป. เมื่อ DDNTP ถูกรวมเข้าด้วยกันโดย DNA polymerase, การขยายสายถูกยกเลิก.
โดยใช้อัตราส่วนของ dntps และ ddntps, การยกเลิกแบบสุ่มเกิดขึ้น, การสร้างชิ้นส่วนดีเอ็นเอของความยาวที่แตกต่างกัน. สิ่งเหล่านี้สามารถคั่นด้วยขนาดเพื่อสร้างลำดับต้นฉบับใหม่.
DDNTPs อนุญาตให้เรียงลำดับของ DNA โดยหยุดการสังเคราะห์ทันทีที่ฐานเฉพาะ. เมื่อเทียบกับ dntps ปกติ, ddntps ขาด 3′ กลุ่มไฮดรอกซิลจำเป็นต้องใช้การยืดตัว.
ความเข้มข้นของ DNTP ทั่วไปใน PCR คืออะไร?
ความเข้มข้นของ DNTP มาตรฐานใน PCR โดยทั่วไป 200 μmของแต่ละ dntp. สิ่งนี้ให้อัตราส่วนที่ดีที่สุดของ DNTPs ต่อเทมเพลต DNA สำหรับการขยายที่มีประสิทธิภาพ.
ต่ำเกินไปของระดับ DNTP สามารถนำไปสู่การขยายที่ไม่เฉพาะเจาะจงและผลผลิตไม่เพียงพอ. สูงเกินไปสามารถลดความแม่นยำและเพิ่มผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจง.
200 μmต่อ DNTP, รวมเป็น 800 μm dntp, เหมาะสำหรับการใช้งาน PCR ส่วนใหญ่. สามารถใช้มากขึ้นหรือน้อยลงหากจำเป็นเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพปฏิกิริยา.
สำหรับ PCRs ยาว, ความเข้มข้นของ DNTP ที่สูงขึ้น (500-1000 ไมโครเมตร) อาจปรับปรุงอัตราผลตอบแทนสำหรับการขยายเป้าหมายดีเอ็นเอที่ยาวขึ้น.
สิ่งสำคัญคือต้องให้ DNTP ทั้งสี่อยู่ในระดับความเข้มข้นเท่ากัน. อัตราส่วนที่ไม่สมดุลสามารถขัดขวางปฏิกิริยา.
บทสรุป
DNTPS เป็นหน่วยการสร้างนิวคลีโอไทด์ที่อนุญาตให้ขยาย PCR ได้. ส่วนประกอบเหล่านี้รวมถึง DATP, ดีทีพี, ดีซีทีพี, และ DGTP.
ในแต่ละรอบ PCR, DNTPs ถูกรวมเข้าด้วยกันโดย Taq polymerase ลงใน DNA strands ใหม่ที่สมบูรณ์กับสายเทมเพลต. สิ่งนี้ช่วยให้การเพิ่มทวีคูณของภูมิภาค DNA เป้าหมายเป็นสองเท่า.
DNTPs เป็นรีเอเจนต์ที่จำเป็นสำหรับ PCR. ไม่มี dntps, DNA polymerase ไม่สามารถสังเคราะห์สำเนาใหม่ของลำดับเป้าหมายได้. การขยายขึ้นอยู่กับการปรากฏตัวของทั้งสี่ dntps.
การทำความเข้าใจบทบาทของ DNTPS ช่วยให้เราชื่นชมวิธีการที่ PCR จัดการในการผลิตชุด DNA หลายพันล้านชุดภายในไม่กี่ชั่วโมง. โดยการจัดหาพื้นผิวพื้นฐานสำหรับการจำลองดีเอ็นเอ, dntps นั่งที่แกนกลางของเทคนิคชีววิทยาโมเลกุลที่ขาดไม่ได้นี้.
