Deoksiribonukleotidni trifosfati (dNTP-ovi) bitne su komponente lančana reakcija polimeraze (PCR). dNTP-ovi služe kao građevni blokovi koji omogućuju replikaciju DNK. Tijekom PCR, dNTP-ovi omogućuju umnožavanje ciljnih sekvenci DNA. Razumijevanje što su dNTP i njihova funkcija ključno je za razumijevanje PCR-a.
Što znači dNTP?
dNTP je kratica za deoksiribonukleotid trifosfat. Deoksiribonukleotidi su monomeri koji čine DNK. Svaki deoksiribonukleotid se sastoji od:
- Dušična baza: adenin (A), timin (T), citozin (C), ili guanin (G).
- Molekula šećera deoksiriboze.
- Trifosfatna skupina.
'Dezoksi’ prefiks označava da je komponenta šećera deoksiriboza, a ne riboza. Deoksiribozi nedostaje atom kisika na 2′ ugljik.
Trifosfat se odnosi na tri fosfata vezana za 5′ ugljik na šećeru. Posjedovanje tri fosfatne skupine čini dNTP visokoenergetskim molekulama.
Koliko vrsta dNTP-a?
Postoje četiri različita dNTP-a, jedan za svaku od DNK baza:
- dATP – deoksiadenozin trifosfat
- dTTP –deoksitimidin trifosfat
- dCTP –deoksicitidin trifosfat
- dGTP –deoksigvanozin trifosfat
Ova četiri dNTP-a osnovni su građevni blokovi potrebni za sintetiziranje novih DNK lanaca.
Što su dNTP u biologiji?
U biologiji, dNTP imaju središnju ulogu u replikaciji DNA i PCR-u:
Replikacija DNK
Tijekom replikacije DNA unutar stanica, dNTP-ovi se ugrađuju u nove DNK lance dok se sintetiziraju. Dvolančana spirala DNK odmotava se i razdvaja u dva jednostruka lanca. Svaka nit djeluje kao predložak za izradu nove komplementarne niti.
DNA polimeraza dodaje dNTP-ove koji su komplementarni matičnom lancu, vezanje preko sparivanja baza. Kako se baze spajaju, šećerno-fosfatne okosnice dNTP-a međusobno su povezane.
To se nastavlja sve dok oba nova lanca ne budu potpune kopije izvorne molekule DNK. DNTP osiguravaju potrebne komponente za konstrukciju novih DNA lanaca.
Lančana reakcija polimerazom
U PCR-u, dNTP-ovi obavljaju istu funkciju kao tijekom replikacije DNK. PCR oponaša replikaciju stanične DNA u epruveti. Ciljna sekvenca DNK više puta se kopira korištenjem ciklusa zagrijavanja i hlađenja.
U svakom ciklusu, dNTP-ove dodaje DNA polimeraza za izgradnju novih lanaca komplementarnih odvojenim predloškim lancima. Ovo eksponencijalno pojačava ciljnu regiju. DNTP-ovi omogućuju brzu sintezu milijardi kopija segmenta DNK.
PCR ne bi mogao nastaviti bez dNTP-a za polimerizaciju novih DNA lanaca.
Kako dNTP djeluju u PCR-u?
dNTP su esencijalni reagens koji omogućuje PCR amplificiranje. Ovdje je pregled kako dNTP funkcioniraju u svakom koraku PCR-a:
Denaturacija
U početnom koraku denaturacije, dvolančana DNA se zagrijava do 94-98°C. Vodikove veze između komplementarnih niti se raskidaju, dajući dvije jednolančane molekule DNA.
Žarenje
Reakcijska temperatura se snižava na 50-65°C kako bi se omogućilo žarenje primera. Prednji i obrnuti početnice vežu se na komplementarne sekvence koje okružuju ciljanu regiju DNA.
Ekstenzija/Elongacija
U ovom koraku, DNA polimeraza dodaje dNTP u početnice, sintetiziranje novih niti komplementarnih predloškim nitima. Temperatura se podiže na 72°C, idealna temperatura za Taq polimeraza aktivnost enzima.
Taq polimeraza dovodi dNTP u par baza s izloženim šablonskim bazama. Kako se svaki dNTP dodaje, između njega i rastućeg lanca DNA nastaje fosfodiesterska veza.
To se nastavlja sve dok se ne formira kompletan komplementarni niz. Rezultat su dvije nove dvolančane kopije DNA koje sadrže ciljnu regiju.
Ponavljanje
Termalni ciklus se ponavlja – zagrijavanje za odvajanje niti, hlađenje za temeljno žarenje, i ekstenzija posredovana polimerazom pomoću dNTP-a.
Svaki ciklus udvostručuje broj kopija DNK. Nakon 30-40 ciklusi, napravljeni su milijuni primjeraka mete.
DNTP dodani u svakoj fazi ekstenzije omogućuju eksponencijalno pojačanje. Bez dNTP-a, nove DNK niti se nisu mogle sintetizirati.
Što se događa ako se dNTP izostave iz PCR-a?
dNTP su bitni i potrebni za PCR. Ako dNTP nisu dodani u PCR glavnu mješavinu, reakcija neće uspjeti.
Bez dNTP-a, Taq polimeraza nema nukleotida za dodavanje početnicama. Stoga, ne može doći do produljenja novih DNA lanaca. Ciljana DNK uopće neće biti umnožena.
Izostavljanje dNTP-a znači da PCR neće raditi, razdoblje. Ostat će samo početnice i predložak DNK bez umnožavanja.
Kontrolna reakcija bez dNTP-a može biti korisna za potvrdu da sinteza DNA ovisi o dNTP-u. Ali normalno, potpuno izostavljanje dNTP-a je automatski neuspjeli PCR eksperiment.
Zašto se ddNTP koriste u sekvenciranju DNK?
U reakcijama sekvenciranja DNK, malo modificirani deoksinukleotidi koji se nazivaju dideoksinukleotidi (ddNTP-ovi) koriste se. ddNTP se razlikuju po tome što sadrže atom vodika na 3′ ugljik, a ne hidroksilna skupina.
ovo 3′ vodik sprječava stvaranje sljedeće fosfodiesterske veze. Kada je ddNTP ugrađen pomoću DNA polimeraze, produženje niti je prekinuto.
Korištenjem omjera dNTP-a i ddNTP-a, dolazi do slučajnog prekida, stvarajući fragmente DNA različitih duljina. Oni se zatim mogu razdvojiti po veličini kako bi se rekonstruirao izvorni niz.
ddNTP-ovi omogućuju sekvenciranje DNK naglim zaustavljanjem sinteze na određenim bazama. U usporedbi s normalnim dNTP-ima, ddNTP-ovima nedostaje 3′ hidroksilnu skupinu potrebnu za nastavak produljenja niti.
Koja je tipična koncentracija dNTP-a u PCR-u?
Standardna koncentracija dNTP-a u PCR-u općenito je 200 μM svakog dNTP-a. Ovo osigurava optimalan omjer dNTP-a i DNA šablona za učinkovito pojačavanje.
Preniska razina dNTP-a može dovesti do nespecifičnog pojačanja i nedovoljnih prinosa. Previsoka može smanjiti točnost i povećati nespecifične proizvode.
200 μM za dNTP, za ukupno 800 μM dNTP, pogodan je za većinu PCR aplikacija. Više ili manje može se koristiti ako je potrebno za optimizaciju reakcije.
Za duge PCR, veća koncentracija dNTP-a (500-1000 μM) može poboljšati prinose za pojačavanje duljih DNA ciljeva.
Važno je zadržati sva četiri dNTP-a u jednakim koncentracijama. Neuravnotežen omjer može spriječiti reakciju.
Zaključak
dNTP su građevni blokovi nukleotida koji omogućuju PCR pojačanje. Ove komponente uključuju dATP, dTTP, dCTP, i dGTP.
U svakom PCR ciklusu, dNTP-ove ugrađuje Taq polimeraza u nove DNA lance komplementarne lancima predloška. To omogućuje eksponencijalno udvostručenje ciljne regije DNK.
dNTP su bitni reagensi za PCR. Bez dNTP-a, DNA polimeraza ne može sintetizirati nove kopije ciljne sekvence. Amplifikacija u potpunosti ovisi o prisutnosti sva četiri dNTP-a.
Razumijevanje uloge dNTP-a pomaže nam shvatiti kako PCR uspijeva proizvesti milijarde kopija segmenata DNK unutar nekoliko sati. Osiguravanjem osnovnih supstrata za replikaciju DNA, dNTP su u središtu ove nezamjenjive tehnike molekularne biologije.
