Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs) sind wesentliche Bestandteile der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). dNTPs dienen als Bausteine, die die DNA-Replikation ermöglichen. Während PCR, dNTPs ermöglichen die Amplifikation von Ziel-DNA-Sequenzen. Um die PCR zu verstehen, ist es wichtig zu verstehen, was dNTPs sind und welche Funktion sie haben.
Wofür steht dNTP??
dNTP steht für Desoxyribonukleotidtriphosphat. Desoxyribonukleotide sind die Monomere, aus denen die DNA besteht. Jedes Desoxyribonukleotid besteht aus:
- Eine stickstoffhaltige Base: Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C), oder Guanin (G).
- Ein Desoxyribose-Zuckermolekül.
- Eine Triphosphatgruppe.
Der ‚Desoxy‘ Das Präfix weist darauf hin, dass es sich bei der Zuckerkomponente um Desoxyribose und nicht um Ribose handelt. Der Desoxyribose fehlt am 2. Platz ein Sauerstoffatom′ Kohlenstoff.
Das Triphosphat bezieht sich auf die drei Phosphate, die an die 5 gebunden sind′ Kohlenstoff auf dem Zucker. Die drei Phosphatgruppen machen dNTPs zu hochenergetischen Molekülen.
Wie viele Arten von dNTPs?
Es gibt vier verschiedene dNTPs, eine für jede der DNA-Basen:
- dATP – Desoxyadenosintriphosphat
- dTTP –Desoxythymidintriphosphat
- dCTP –Desoxycytidintriphosphat
- dGTP –Desoxyguanosintriphosphat
Diese vier dNTPs sind die Grundbausteine, die für die Synthese neuer DNA-Stränge benötigt werden.
Was sind dNTPs in der Biologie??
In der Biologie, dNTPs spielen eine zentrale Rolle bei der DNA-Replikation und PCR:
DNA-Replikation
Während der DNA-Replikation in Zellen, dNTPs werden bei der Synthese in neue DNA-Stränge eingebaut. Die doppelsträngige DNA-Helix entwindet sich und spaltet sich in zwei Einzelstränge. Jeder Strang dient als Vorlage für die Herstellung eines neuen komplementären Strangs.
Die DNA-Polymerase fügt dNTPs hinzu, die zum Matrizenstrang komplementär sind, Bindung über Basenpaarung. Während sich die Basen paaren, Die Zucker-Phosphat-Grundgerüste der dNTPs sind miteinander verbunden.
Dies wird so lange fortgesetzt, bis beide neuen Stränge vollständige Kopien des ursprünglichen DNA-Moleküls sind. Die dNTPs liefern die notwendigen Komponenten zum Aufbau der neuen DNA-Stränge.
Polymerase Kettenreaktion
Bei der PCR, dNTPs erfüllen die gleiche Funktion wie bei der DNA-Replikation. PCR ahmt die zelluläre DNA-Replikation in einem Reagenzglas nach. Die Ziel-DNA-Sequenz wird mithilfe von Heiz- und Kühlzyklen wiederholt kopiert.
In jedem Zyklus, dNTPs werden durch DNA-Polymerase hinzugefügt, um neue Stränge zu bilden, die zu den getrennten Matrizensträngen komplementär sind. Dadurch wird die Zielregion exponentiell verstärkt. Die dNTPs ermöglichen die schnelle Synthese von Milliarden Kopien des DNA-Segments.
Ohne dNTPs zur Polymerisierung neuer DNA-Stränge könnte die PCR nicht durchgeführt werden.
Wie funktionieren dNTPs in der PCR??
dNTPs sind ein essentielles Reagenz, das die PCR-Amplifikation ermöglicht. Hier finden Sie einen Überblick darüber, wie dNTPs in den einzelnen PCR-Schritten funktionieren:
Denaturierung
Im ersten Denaturierungsschritt, Die doppelsträngige DNA wird auf 94-98°C erhitzt. Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Strängen brechen auf, Es entstehen zwei einzelsträngige DNA-Moleküle.
Glühen
Die Reaktionstemperatur wird auf 50–65 °C gesenkt, um das Aushärten des Primers zu ermöglichen. Vorwärts- und Rückwärtsprimer binden an komplementäre Sequenzen, die die Ziel-DNA-Region flankieren.
Verlängerung/Verlängerung
In diesem Schritt, Die DNA-Polymerase fügt den Primern dNTPs hinzu, Synthese neuer Stränge, die zu den Matrizensträngen komplementär sind. Die Temperatur wird auf 72°C erhöht, die ideale Temperatur für Taq-Polymerase Enzymaktivität.
Die Taq-Polymerase bringt die dNTPs dazu, ein Basenpaar mit den freigelegten Matrizenbasen zu bilden. Da jedes dNTP hinzugefügt wird, Zwischen ihm und dem wachsenden DNA-Strang bildet sich eine Phosphodiesterbindung.
Dies wird so lange fortgesetzt, bis die vollständige komplementäre Sequenz gebildet ist. Das Ergebnis sind zwei neue doppelsträngige DNA-Kopien, die die Zielregion enthalten.
Wiederholung
Der Temperaturwechsel wiederholt sich – Erhitzen, um die Stränge zu trennen, Kühlung zum Primer-Glühen, und Polymerase-vermittelte Verlängerung unter Verwendung von dNTPs.
Jeder Zyklus verdoppelt die Anzahl der DNA-Kopien. Nach 30-40 Fahrräder, Es werden Millionen Kopien des Ziels hergestellt.
Die in jeder Verlängerungsphase hinzugefügten dNTPs ermöglichen die exponentielle Verstärkung. Ohne dNTPs, Neue DNA-Stränge konnten nicht synthetisiert werden.
Was passiert, wenn dNTPs bei der PCR weggelassen werden??
dNTPs sind für die PCR essentiell und erforderlich. Wenn dem PCR-Mastermix keine dNTPs hinzugefügt werden, die Reaktion wird scheitern.
Ohne dNTPs, Die Taq-Polymerase muss den Primern keine Nukleotide hinzufügen. daher, die Verlängerung neuer DNA-Stränge kann nicht stattfinden. Die Ziel-DNA wird überhaupt nicht amplifiziert.
Das Weglassen von dNTPs bedeutet, dass die PCR nicht funktioniert, Zeitraum. Ohne Amplifikation bleiben nur Primer und Matrizen-DNA übrig.
Eine Kontrollreaktion ohne dNTPs kann nützlich sein, um zu bestätigen, dass die DNA-Synthese von dNTPs abhängt. Aber normalerweise, Das vollständige Weglassen von dNTPs ist ein automatisch fehlgeschlagenes PCR-Experiment.
Warum werden ddNTPs bei der DNA-Sequenzierung verwendet??
Bei DNA-Sequenzierungsreaktionen, leicht modifizierte Desoxynukleotide, sogenannte Didesoxynukleotide (ddNTPs) werden verwendet. ddNTPs unterscheiden sich dadurch, dass sie an der 3. Stelle ein Wasserstoffatom enthalten′ Kohlenstoff statt einer Hydroxylgruppe.
Dieses 3′ Wasserstoff verhindert die Bildung der nächsten Phosphodiesterbindung. Wenn ein ddNTP durch DNA-Polymerase eingebaut wird, Die Strangverlängerung wird beendet.
Durch Verwendung eines Verhältnisses von dNTPs und ddNTPs, Es erfolgt eine zufällige Beendigung, Es entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge. Diese können dann nach Größe getrennt werden, um die ursprüngliche Sequenz zu rekonstruieren.
ddNTPs ermöglichen die Sequenzierung von DNA, indem sie die Synthese an bestimmten Basen abrupt stoppen. Im Vergleich zu normalen dNTPs, ddNTPs fehlen die 3′ Hydroxylgruppe, die zur Fortsetzung der Strangverlängerung benötigt wird.
Was ist die typische dNTP-Konzentration in der PCR??
Die Standard-dNTP-Konzentration in einer PCR beträgt im Allgemeinen 200 μM jedes dNTP. Dies sorgt für ein optimales Verhältnis von dNTPs zu DNA-Vorlagen für eine effiziente Amplifikation.
Ein zu niedriger dNTP-Wert kann zu unspezifischer Amplifikation und unzureichenden Ausbeuten führen. Ein zu hoher Wert kann die Genauigkeit verringern und zu unspezifischen Produkten führen.
200 μM für dNTPs, Für insgesamt 800 μM dNTP, ist für die meisten PCR-Anwendungen geeignet. Bei Bedarf kann mehr oder weniger verwendet werden, um die Reaktion zu optimieren.
Für lange PCRs, eine höhere dNTP-Konzentration (500-1000 μM) kann die Ausbeute bei der Amplifikation längerer DNA-Ziele verbessern.
Es ist wichtig, dass alle vier dNTPs in gleichen Konzentrationen vorhanden sind. Ein unausgeglichenes Verhältnis kann die Reaktion behindern.
Abschluss
dNTPs sind die Nukleotidbausteine, die die PCR-Amplifikation ermöglichen. Zu diesen Komponenten gehört dATP, dTTP, dCTP, und dGTP.
In jedem PCR-Zyklus, dNTPs werden durch die Taq-Polymerase in neue DNA-Stränge eingebaut, die zu den Matrizensträngen komplementär sind. Dies ermöglicht eine exponentielle Verdoppelung der Ziel-DNA-Region.
dNTPs sind wesentliche Reagenzien für die PCR. Ohne dNTPs, Die DNA-Polymerase kann keine neuen Kopien der Zielsequenz synthetisieren. Die Amplifikation hängt vollständig von der Anwesenheit aller vier dNTPs ab.
Das Verständnis der Rolle von dNTPs hilft uns zu verstehen, wie es PCR gelingt, innerhalb von Stunden Milliarden Kopien von DNA-Segmenten zu produzieren. Durch die Bereitstellung der Grundsubstrate für die DNA-Replikation, dNTPs bilden den Kern dieser unverzichtbaren molekularbiologischen Technik.
