Deoxyribonucleotide trifosfati (dntps) sono componenti essenziali del Reazione a catena della polimerasi (PCR). I DNTP fungono da elementi costitutivi che consentono la replicazione del DNA. Durante PCR, DNTPS abilita l'amplificazione delle sequenze di DNA target. Capire cosa sono i DNTP e la loro funzione è la chiave per apprezzare la PCR.
Cosa significa DNTP?
DNTP sta per il trifosfato di deossiribonucleotide. I deossiribonucleotidi sono i monomeri che trucco DNA. Ogni deossiribonucleotide è composto da:
- Una base azotata: adenina (UN), timina (T), citosina (C), o guanina (G).
- Una molecola di zucchero desossiribosio.
- Un gruppo trifosfato.
Il "deossista’ Il prefisso indica che il componente di zucchero è desossiribosio piuttosto che ribosio. Il desossiribosio manca di un atomo di ossigeno sul 2′ carbonio.
Il trifosfato si riferisce ai tre fosfati attaccati al 5′ carbonio sullo zucchero. Avere tre gruppi di fosfato produce molecole ad alta energia DNTP.
Quanti tipi di DNTP?
Ci sono quattro diversi DNTP, uno per ciascuna delle basi del DNA:
- dATP – Deossiadenosina trifosfato
- dTTP –deossitimidina trifosfato
- dCTP –deossictidina trifosfato
- dGTP –deossyguanosine trifosfato
Questi quattro DNTP sono i blocchi di base necessari per sintetizzare nuovi fili di DNA.
Cosa sono i DNTP in biologia?
In biologia, I DNTP hanno un ruolo centrale nella replicazione del DNA e nella PCR:
Replicazione del DNA
Durante la replicazione del DNA all'interno delle cellule, I DNTP sono incorporati in nuovi fili di DNA in quanto sono sintetizzati. L'elica di DNA a doppio filamento si snoda e si divide in due singoli fili. Ogni filo funge da modello per un nuovo filo complementare da realizzare.
La DNA polimerasi aggiunge DNTP che sono complementari al filo del modello, Binding tramite l'accoppiamento di base. Mentre le basi si abbinano, Le spine dello zucchero-fosfato dei DNTP sono collegate insieme.
Questo continua fino a quando entrambi i nuovi fili sono copie complete della molecola di DNA originale. I DNTP forniscono i componenti necessari per costruire i nuovi fili di DNA.
Reazione a catena della polimerasi
In PCR, DNTPS eseguono la stessa funzione della replicazione del DNA. La PCR imita la replicazione del DNA cellulare in un tubo di prova. La sequenza del DNA target viene ripetutamente copiata usando cicli di riscaldamento e raffreddamento.
In ogni ciclo, I DNTP sono aggiunti dalla DNA polimerasi per costruire nuovi fili complementari ai fili di modelli separati. Ciò amplifica esponenzialmente la regione target. I DNTP consentono una rapida sintesi di miliardi di copie del segmento del DNA.
La PCR non potrebbe procedere senza DNTPS per polimerizzare nuovi fili di DNA.
Come funzionano i DNTP in PCR?
I DNTP sono un reagente essenziale che consente l'amplificazione PCR. Ecco una panoramica di come funzionano i DNTP in ogni fase di PCR:
Denaturazione
Nella fase iniziale di denaturazione, Il DNA a doppio filamento viene riscaldato fino a 94-98 ° C. I legami idrogeno tra i fili complementari si rompono, producendo due molecole di DNA a singolo filamento.
Ricottura
La temperatura di reazione viene ridotta a 50-65 ° C per consentire la ricottura del primer. I primer in avanti e inverso si legano a sequenze complementari che fiancheggiano la regione del DNA target.
Estensione/allungamento
In questo passaggio, Il DNA polimerasi aggiunge DNTP ai primer, Sintetizzare nuovi fili complementari ai fili del modello. La temperatura è aumentata a 72 ° C, la temperatura ideale per Taq polimerasi attività enzimatica.
Taq polimerasi porta il dNTPS per la coppia di basi con le basi del modello esposte. Come viene aggiunto ogni DNTP, Un legame fosfodiestro si forma tra esso e il filo di DNA in crescita.
Ciò continua fino a formare la sequenza complementare completa. Il risultato è due nuove copie di DNA a doppio filamento contenenti la regione target.
Ripetizione
Il ciclismo termico si ripete – riscaldamento per separare i fili, raffreddamento per ricottura del primer, e estensione mediata dalla polimerasi usando DNTP.
Ogni ciclo raddoppia il numero di copie del DNA. Dopo 30-40 cicli, milioni di copie del bersaglio vengono realizzate.
I DNTP aggiunti in ciascuna fase di estensione consentono l'amplificazione esponenziale. Senza dntps, Nuovi fili di DNA non potevano essere sintetizzati.
Cosa succede se i DNTP sono esclusi dalla PCR?
I DNTP sono essenziali e richiesti per la PCR. Se i DNTP non vengono aggiunti al mix Master PCR, La reazione fallirà.
Senza dntps, Taq polimerasi non ha nucleotidi da aggiungere ai primer. Perciò, Non può verificarsi l'allungamento di nuovi fili di DNA. Il DNA target non sarà affatto amplificato.
Trasmettere DNTPS significa che la PCR non funzionerà, periodo. Solo i primer e il DNA modello rimarranno senza amplificazione.
Una reazione di controllo priva di DNTP può essere utile per confermare che la sintesi del DNA dipende da DNTP. Ma normalmente, L'omissione completa di DNTPS è un esperimento PCR fallito automatico.
Perché i DDNTP sono usati nel sequenziamento del DNA?
Nelle reazioni di sequenziamento del DNA, Deossinucleotidi leggermente modificati chiamati dideossinucleotidi (ddntps) sono usati. DDNTP differisce contenente un atomo di idrogeno sul 3′ carbonio piuttosto che un gruppo idrossilico.
Questo 3′ L'idrogeno impedisce la formazione del prossimo legame fosfodiestro. Quando un DDNTP è incorporato dalla DNA polimerasi, L'estensione Strand è terminata.
Usando un rapporto di DNTPS e DDNTPS, Si verifica la terminazione casuale, Generare frammenti di DNA di varie lunghezze. Questi possono quindi essere separati per dimensioni per ricostruire la sequenza originale.
DDNTPS consente il sequenziamento del DNA fermando bruscamente la sintesi in basi specifiche. Rispetto al normale DNTPS, DDNTPS non ha il 3′ Il gruppo idrossilico doveva continuare l'allungamento.
Qual è la tipica concentrazione di DNTP nella PCR?
La concentrazione di DNTP standard in una PCR è generalmente 200 μm di ogni dNTP. Ciò fornisce un rapporto ottimale di DNP e modelli di DNA per un'amplificazione efficiente.
Troppo basso di un livello DNTP può portare a un'amplificazione non specifica e rese insufficienti. Troppo alto può ridurre la precisione e aumentare i prodotti non specifici.
200 μm per dNTP, per un totale di 800 μm dntp, è adatto per la maggior parte delle applicazioni PCR. Più o meno può essere usato se necessario per ottimizzare la reazione.
Per lunghe PCR, una concentrazione di DNTP più elevata (500-1000 μm) può migliorare i rendimenti per amplificare gli obiettivi di DNA più lunghi.
È importante mantenere tutti e quattro i DNTP presenti a uguali concentrazioni. Un rapporto sbilanciato può ostacolare la reazione.
Conclusione
I DNTP sono i mattoni nucleotidici che consentono l'amplificazione della PCR. Questi componenti includono DATP, dTTP, dCTP, e dgtp.
In ogni ciclo PCR, I DNTP sono incorporati da Taq polimerasi in nuovi fili di DNA complementari ai fili del modello. Ciò consente il raddoppio esponenziale della regione del DNA target.
I DNTP sono reagenti essenziali per la PCR. Senza dntps, DNA polimerasi non può sintetizzare nuove copie della sequenza target. L'amplificazione dipende interamente dalla presenza di tutti e quattro i DNTP.
Comprendere il ruolo di DNTPS ci aiuta ad apprezzare il modo in cui la PCR riesce a produrre miliardi di copie di segmenti di DNA entro ore. Fornendo i substrati di base per la replica del DNA, I DNTP si siedono al centro di questa indispensabile tecnica di biologia molecolare.
