β-galactosidase (β-GAL) Kit d'analyse
Note: Prenez deux ou trois échantillons différents pour la prédiction avant le test.
Équipement d'exploitation: Microplate Reader/Spectrophotometer
Numéro de catalogue: BC2585
Taille:100T/48S
Composants:
Extraire la solution: Liquide 100 mL×1. Stockage à 4℃.
Solution I: Poudre × 1. Stockage à -20℃. Ajouter 2.55 mL of distilled water to per bottle before use and dissolve it fully. The left reagent store at -20℃.
Solution Ⅱ: Liquide 4 mL×1. Stockage à 4℃.
Solution Ⅲ: Liquide 15 mL×1. Stockage à 4℃.
Standard: Liquide 1 ml × 1. Stockage à 4℃. 5 μmol/mL p-nitrophenol solution.
Description du produit
β-galactosidase (β-GAL, CE 3.2.1.23) is an enzyme found broadly in animals, plantes, micro-organismes et cellules cultivées, which can catalyze the hydrolysis of β-galactosyl bonds and also has the function of transglycosylation. β-GAL can release stored energy for the rapid growth of plants, also catalyzes the degradation of polysaccharides, glycoproteins, and galactose terminal galactose residues in normal polysaccharide metabolism, cell wall component metabolism and during aging cell wall to release free galactose.
β-GAL can catalyze the p-nitro phenyl-β-pyran galactoside to p-nitro phenol. The product has characteristic of absorption at 400 nm. Dans ce kit, the β-GAL activity is quantified by measuring the increase in the color development at 400 nm.
Réactifs et équipements requis mais non fournis.
Lecteur de microplaques ou spectrophotomètre, centrifuger, bain d'eau, pipette de transfert, cuvette en verre micro/plaque à fond plat de 96 puits, glace, mortar/homogenizer and distilled water.
Procédure
je. Preparation of standard samples:
- Bactéries ou cellules
Collecte de bactéries ou de cellules dans le tube à centrifuger, after centrifugation discard supernatant. Suggest add 1 ml de solution d'extrait 5 millions de bactéries ou de cellules. Utilisez une ultrasonication pour diviser les bactéries et les cellules (placé sur la glace, puissance ultrasonique 20%, temps de travail 3 secondes, intervalle 10 secondes, répéter pour 30 fois). Centrifuge at 15000×g for 20 minutes à 4 ℃ pour éliminer les matériaux insolubles et prendre le surnageant sur la glace avant de tester.
- Tissu
Ajouter 1 ml de solution d'extrait 0.1 g de tissu, and fully homogenized on ice bath. Centrifuge at 15000×g for 20 minutes à 4℃ pour éliminer les matières insolubles, et prendre le surnageant sur la glace avant de tester.
II. Détermination
- Preheat the microplate reader or spectrophotometer for more than 30 minutes, ajuster la longueur d'onde à 400 nm, mettre à zéro avec de l'eau distillée.
- Standard Dilute the solution to 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0 nmol/mL with distilled water.
- Ajoutez des réactifs avec la liste suivante:
| Réactif | Éprouvette (T) | Contrast Tube (C) | Tube standard (S) |
| Solution I (µL) | 25 | – | – |
| Eau distillée (µL) | – | 25 | – |
| Solution Ⅱ (µL) | 35 | 35 | – |
| Échantillon (µL) | 10 | 10 | – |
| Mix thoroughly and incubate the reaction for 30 minutes at 37℃ water bath. | |||
| Standard (µL) | – | – | 70 |
| Solution Ⅲ (µL) | 130 | 130 | 130 |
Bien mélanger. Detect the absorbance of each tube at 400 nm and noted as AT, CA, AS and AB. Calculate
ΔAT= AT – CA, ΔAS = AS – UN B. Each test tube should be provided with one contrast tube.
III. Calculate:
1. Courbe standard
Standard curve established: According to the concentration of the standard tube (y nmol/mL) and absorbance ΔAS= AS – UN B (X), establish the standard curve. Add ΔA into the standard curve, and calculate the amount of product generated by the sample (nmoles/mL).
2. Calcul
- Concentration de protéines tissulaires
Définition de l'unité: Une unité d’activité enzymatique est définie comme la quantité d’enzymes catalysant la génération de 1 nmol of p-nitrophenol in the reaction system per hour, every mg protein.
β-GAL Activity(U/mg prot)=(y×Vrv)÷(Vs × Cpr)÷T=14×y÷Cpr
- Poids tissulaire
Définition de l'unité: Une unité d’activité enzymatique est définie comme la quantité d’enzymes catalysant la génération de 1 nmol of p-nitrophenol in the reaction system per hour, every g sample.
β-GAL Activity(U/g )= (y×Vrv)÷(W × vs ÷ ve)÷T=14×y÷W
- Bactéries ou cellules cultivées
Définition de l'unité: Une unité d’activité enzymatique est définie comme la quantité d’enzymes catalysant la génération de 1 nmol of p-nitrophenol in the reaction system per hour, chaque 104 bactéries ou cellules.
β-GAL Activity(Cellule U/104)=(y×Vrv)÷(500× vs ÷ ve)÷T=0.028×y
Cpr: Concentration en protéines de l'échantillon surnageant (mg/ml); Corde: Volume total de réaction, 0.07 ml;
Contre: Volume surnageant, 0.01 ml; Ve: Extraire le volume de la solution,1 ml;
T: Temps de réaction (min), 30 minutes = 0.5 heure; W: Poids de l'échantillon, g;
500: 5 millions de cellules ou de bactéries.
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