วัตถุประสงค์ของการสกัด RNA คืออะไร? ความแตกต่างระหว่างการสกัด DNA และ RNA

การสกัดกรดนิวคลีอิกเป็นเทคนิคพื้นฐานในการวิจัยอณูชีววิทยาและพันธุศาสตร์. การแยก DNA และ RNA ออกจากตัวอย่างทางชีววิทยาถือเป็นวัสดุเริ่มต้นสำหรับการศึกษาการแสดงออกของยีน, ตรวจจับเชื้อโรค, วิเคราะห์การกลายพันธุ์, และอีกมากมาย. อย่างไรก็ตาม, ความแตกต่างที่สำคัญระหว่างโครงสร้าง DNA และ RNA และความเสถียรจำเป็นต้องมีโปรโตคอลการสกัดเฉพาะทางที่ปรับให้เหมาะสมสำหรับกรดนิวคลีอิกแต่ละประเภท.

ทำไมเรา สกัดอาร์เอ็นเอ?

RNA มีบทบาทสำคัญในเซลล์. สาเหตุหลักที่เราสกัด RNA คือ:

• เพื่อศึกษาการแสดงออกของยีน – ปริมาณ RNA ที่ผลิตจากยีนต่างๆ ให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับกิจกรรมของเซลล์. การวิเคราะห์ระดับ RNA ด้วยเชิงปริมาณ พีซีอาร์ หรือการจัดลำดับ RNA ช่วยให้เราเข้าใจกระบวนการพัฒนาและวิธีที่เซลล์ตอบสนองต่อสภาวะที่เปลี่ยนแปลงไป.
• เพื่อทำ RT-PCR – การแยก RNA ทำให้สามารถแปลงเป็น cDNA ได้โดยการถอดรหัสแบบย้อนกลับ. จากนั้น cDNA จะสามารถใช้เป็นเทมเพลตสำหรับการขยายและการวิเคราะห์ PCR.
• สำหรับการตรวจจับไวรัส – การปรากฏตัวของไวรัส RNA บ่งบอกถึงการติดเชื้อไวรัสที่ใช้งานอยู่. การแยก RNA จากตัวอย่างผู้ป่วยทำให้สามารถวินิจฉัยไวรัส RNA เช่น ไข้หวัดใหญ่ได้, ไวรัสโคโรน่า, และรีโทรไวรัส.
• การทดลองทำให้ยีนเงียบ – การแนะนำ siRNA หรือ miRNA ที่สังเคราะห์ขึ้นเองเข้าไปในเซลล์สามารถลดระดับ mRNA เป้าหมายได้, ยับยั้งยีนจำเพาะ. การสกัดอาร์เอ็นเอ ตรวจสอบการล้มลง.
• การศึกษาโครงสร้างและหน้าที่ของ RNA – การแยก RNA ที่ไม่เสียหายออกเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการศึกษาการพับ RNA, การปรับเปลี่ยน, การโต้ตอบ, และกิจกรรมของเอนไซม์.
• การทำโปรไฟล์การแสดงออกของยีน – การรวบรวม RNA ทั้งหมดในเซลล์คือการถอดเสียง. การวิเคราะห์การถอดเสียงจะให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับการควบคุมยีนทั่วโลก.

ความแตกต่างที่สำคัญระหว่าง RNA และ DNA ส่งผลต่อการสกัด

แม้ว่าทั้งคู่จะเป็นกรดนิวคลีอิกก็ตาม, RNA และ DNA มีความแตกต่างที่สำคัญซึ่งทำให้เกิดความแตกต่างในวิธีการสกัด:

1. RNA มีความเสถียรทางเคมีน้อยกว่า DNA

• น้ำตาลไรโบสใน RNA มีหมู่ไฮดรอกซิล (-โอ้) ติดไว้ที่ 2′ ตำแหน่ง. สิ่งนี้ทำให้แกนหลักฟอสโฟไดสเตอร์มีแนวโน้มที่จะเกิดการไฮโดรไลซิสตามธรรมชาติมากขึ้น.
• นอกจากนี้ RNA ยังถูกย่อยสลายได้ง่ายด้วยไรโบนิวคลีเอส (อาร์เนส) เอนไซม์. RNases มีความเสถียรและยากต่อการถูกทำลาย, และมีปริมาณน้อยมากที่จะแยกส่วน RNA อย่างรวดเร็ว.
• ในทางตรงกันข้าม, DNA ขาด 2′ กลุ่มไฮดรอกซิลและไม่ได้กำหนดเป้าหมายโดย RNases. สิ่งนี้ทำให้ DNA มีเสถียรภาพมากกว่า RNA ทางเคมี.

2. ค่า pH ที่เหมาะสมสำหรับการสกัดจะแตกต่างกันไป

• DNA มีความเสถียรมากที่สุดในระหว่างการสกัดที่ pH เป็นกลางหรือเป็นด่างเล็กน้อย 7-8.
• อย่างไรก็ตาม, pH สูงกว่า 7 ส่งเสริมการไฮโดรไลซิสอัลคาไลน์ของ RNA เนื่องจากไรโบส 2′-โอ้. สภาวะที่เป็นกรดต่ำกว่า pH 5 จำเป็นสำหรับ RNA.
• ความแตกต่างของค่า pH ที่เหมาะสมที่สุดนี้ถือเป็นความท้าทายที่สำคัญเมื่อแยกทั้งสองอย่างพร้อมกัน.

3. ความอุดมสมบูรณ์ของเซลล์และข้อกำหนดตัวอย่าง

• มีสำเนาจีโนม DNA จำนวนมากอยู่ภายในแต่ละเซลล์, ทำให้สามารถแยกปริมาณไมโครกรัมได้อย่างง่ายดาย.
• แหล่งรวมของ RNA ประเภทต่างๆ ที่ถูกสกัดขึ้นอยู่กับระดับการแสดงออกเฉพาะของเนื้อเยื่อ. โดยทั่วไปจะได้รับปริมาณนาโนแกรม.
• ดังนั้น, RNA ต้องการการจัดการและการเพิ่มประสิทธิภาพอย่างระมัดระวังมากขึ้นเพื่อแยกจำนวนนาทีที่มีอยู่ให้ครบถ้วน.

การเปรียบเทียบแบบทีละขั้นตอนของโปรโตคอลการสกัด RNA และ DNA

โดยคำนึงถึงความแตกต่างที่สำคัญเหล่านั้น, เรามาตรวจสอบวิธีการพิเศษที่ใช้ในแต่ละขั้นตอนของการสกัด RNA และ DNA กัน:

1. ตัวอย่างการหยุดชะงักและการทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน

• สำหรับทั้ง DNA และ RNA, ขั้นแรกจำเป็นต้องสลายเซลล์เพื่อทำลายเยื่อหุ้มเซลล์และปล่อยกรดนิวคลีอิก. วิธีการต่างๆ ได้แก่ การหยุดชะงักทางกายภาพโดยการบดตัวอย่างเนื้อเยื่อที่แช่แข็ง.
• อย่างไรก็ตาม, ต้องเติมสารยับยั้ง RNase ลงในตัวอย่าง RNA ทันทีในระหว่างขั้นตอนนี้เพื่อหยุดการทำงานของไรโบนิวคลีเอสจำนวนมากที่ปล่อยออกมา. ไม่มีการใช้สารยับยั้งสำหรับ DNA.

2. การแยกกรดนิวคลีอิกจากส่วนประกอบของเซลล์

• สำหรับการสกัดดีเอ็นเอ, การเติมสารละลายเกลือเข้มข้นทำให้เกิดการตกตะกอนของโปรตีนในขณะที่ปล่อยให้ DNA ละลายได้.
• สำหรับอาร์เอ็นเอ, เกลือ chaotropic เหมือนเข้มข้น กัวนิดิเนียม ไอโซไทโอไซยาเนต ทำลายโปรตีนอย่างรวดเร็วในขณะเดียวกันก็หยุดการทำงานของ RNases.
• การสกัดแบบอินทรีย์ด้วยฟีนอลและคลอโรฟอร์มช่วยแยกกรดนิวคลีอิกที่ปล่อยออกมาจากโปรตีน, ไขมัน, และคาร์โบไฮเดรตสำหรับทั้ง DNA และ RNA.

3. การตกตะกอนและการฟื้นตัวของกรดนิวคลีอิก

• การตกตะกอนของเอทานอลหรือไอโซโพรพานอลจะแยก DNA หรือ RNA ออกจากสารละลายที่เป็นน้ำ. สภาพที่มีความเค็มเล็กน้อยช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการตกตะกอนของ RNA.
• เนื่องจากปริมาณ RNA นาที, สารตกตะกอนร่วมเช่นไกลโคเจนหรืออะคริลาไมด์เชิงเส้นถูกนำมาใช้เพื่อสร้างเม็ด RNA ที่มองเห็นได้.
• DNA ที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงจะตกตะกอนได้ง่ายในขณะที่ RNA ยังคงละลายได้ในเอทานอลภายใต้สภาวะบัฟเฟอร์จำเพาะ. สิ่งนี้ทำให้พวกเขาแยกจากกัน.

4. การกำจัดสารปนเปื้อน

• การเตรียม DNA ได้รับการบำบัดด้วย RNase เพื่อกำจัดชิ้นส่วน RNA ที่ถูกทำให้บริสุทธิ์ร่วม.
• เช่นเดียวกัน, การย่อย DNase ที่ปราศจาก RNase จะกำจัด DNA จากสารสกัด RNA.
• การทำให้บริสุทธิ์เพิ่มเติมอาจทำได้โดยใช้คอลัมน์หมุน, การสกัดฟีนอล, หรือขั้นตอนการตกตะกอนเพื่อขจัดเกลือ, เอนไซม์, คาร์โบไฮเดรต, และสารปนเปื้อนอื่นๆ.

การประเมินปริมาณ, ความบริสุทธิ์, และความซื่อสัตย์

การควบคุมคุณภาพอย่างเข้มงวดเป็นสิ่งจำเป็นเพื่อให้แน่ใจว่า DNA และ RNA ที่สกัดออกมานั้นเหมาะสมกับเทคนิคการวิเคราะห์ที่มีความละเอียดอ่อน:

การหาปริมาณระดับกรดนิวคลีอิก

• การดูดซับรังสียูวีที่ 260 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์จะประมาณความเข้มข้นผ่านกฎเบียร์-แลมเบิร์ต.
• การหาปริมาณฟลูออโรเมตริกโดยใช้สีย้อมเช่น ซีบีอาร์ สีเขียว I มีความไวและแม่นยำมากกว่าการดูดกลืนรังสียูวี.

การประเมินความบริสุทธิ์

• อัตราส่วน A260/A280 ตรวจจับการปนเปื้อนของโปรตีนหรือฟีนอล. DNA/RNA บริสุทธิ์มีอัตราส่วนอยู่รอบๆ 1.8.
• อัตราส่วนความยาวคลื่นเพิ่มเติม เช่น A260/A230 สามารถตรวจจับการปนเปื้อนของโพลีแซ็กคาไรด์หรือการปนเปื้อนแบบ chaotropic.

การประเมินความสมบูรณ์ของ RNA

• อิเล็กโตรโฟเรซิสเผยให้เห็นว่า RNA นั้นไม่เสียหายหรือเสื่อมโทรมลง. แถบไรโบโซมอล RNA ที่คมชัด 28S และ 18S เป็นตัวแทนของ RNA ที่ไม่บุบสลาย.
• หมายเลขความสมบูรณ์ของ RNA (ริน) อัลกอริธึมให้คะแนนคุณภาพ RNA อย่างเป็นกลางจากอิเล็กโตรฟีโรแกรม.
• RNA ที่เสื่อมโทรมจะปรากฏเป็นรอยเปื้อนแทนที่จะเป็นแถบแยกกัน และไม่เหมาะสำหรับการตรวจวิเคราะห์แบบดาวน์สตรีม.

บทสรุป

ในขณะที่การสกัด DNA และ RNA มีหลักการร่วมกันบางประการ, RNA มีแนวโน้มที่จะย่อยสลายได้ง่ายกว่า และต้องมีขั้นตอนเฉพาะเพื่อแยกให้ไม่เสียหาย. การทำความเข้าใจความแตกต่างที่สำคัญเหล่านี้ช่วยให้นักวิจัยได้รับกรดนิวคลีอิกคุณภาพสูงสำหรับการใช้งานขั้นปลายที่มีความละเอียดอ่อน. ด้วยการฝึกฝน, โปรโตคอลการสกัดสามารถปรับแต่งได้อย่างละเอียดเพื่อให้ได้ RNA ที่เหมาะสมที่สุดและ การทำให้ดีเอ็นเอบริสุทธิ์ จากแหล่งทางชีวภาพที่หลากหลาย.

คำถามที่พบบ่อย

เหตุใดจึงจำเป็นต้องใช้สารยับยั้ง RNase?

RNases สลาย RNA อย่างรวดเร็วในระหว่างการสกัด. สารยับยั้ง RNase จะจับและยับยั้งเอนไซม์เหล่านี้อย่างถาวร, รักษา RNA ที่ไม่บุบสลาย.

เนื้อเยื่อที่ดีที่สุดในการสกัด RNA คืออะไร?

RNA มีมากมายในเนื้อเยื่อที่มีฤทธิ์ในการเผาผลาญเช่นตับ, ไต, หรือการแบ่งเซลล์อย่างแข็งขัน. สิ่งเหล่านี้ให้ผลตอบแทนสูง. เนื้อเยื่อที่มีระดับ RNase สูง เช่น ตับอ่อนหรือผิวหนัง จะมีความท้าทายมากกว่า.

หลังจากการสกัด RNA สามารถเก็บไว้ได้นานแค่ไหน?

RNA ที่แยกออกมาควรเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -80°C ในน้ำที่ปราศจากนิวคลีเอส. ภายใต้สภาวะที่เหมาะสม, RNA อาจคงสภาพไว้เป็นเวลาหนึ่งปี แต่การย่อยสลายบางส่วนยังคงเกิดขึ้นเมื่อเวลาผ่านไป.

การเลือกชุดสกัดช่วยสร้างความแตกต่างหรือไม่?

ใช่, ส่วนประกอบของชุดอุปกรณ์ เช่น บัฟเฟอร์สลายและสารยับยั้ง RNase ส่งผลต่อคุณภาพของ RNA. ชุดอุปกรณ์บางอย่างทำงานได้ดีกว่าสำหรับการใช้งานเฉพาะ เช่น การจัดลำดับ qPCR หรือ RNA.