Ekstraksi asam nukleat adalah teknik mendasar dalam penelitian biologi molekuler dan genetika. Mengisolasi DNA dan RNA dari sampel biologis menyediakan bahan awal untuk mempelajari ekspresi gen, Mendeteksi patogen, menganalisis mutasi, dan banyak lagi. Namun, Perbedaan penting antara struktur DNA dan RNA dan stabilitas mengharuskan protokol ekstraksi khusus yang dioptimalkan untuk setiap jenis asam nukleat.
Mengapa Kita Ekstrak RNA?
RNA melakukan banyak peran penting dalam sel. Alasan utama kami mengekstrak RNA adalah:
- Untuk mempelajari ekspresi gen – Jumlah RNA yang dihasilkan dari gen berbeda memberikan wawasan tentang aktivitas seluler. Menganalisis kadar RNA secara kuantitatif PCR atau pengurutan RNA memungkinkan kita memahami proses perkembangan dan bagaimana sel merespons perubahan kondisi.
- Untuk melakukan RT-PCR – Mengekstraksi RNA memungkinkannya diubah menjadi cDNA melalui transkripsi terbalik. CDNA kemudian dapat digunakan sebagai templat untuk amplifikasi dan analisis PCR.
- Untuk deteksi virus – Kehadiran RNA virus menunjukkan infeksi virus aktif. Mengekstraksi RNA dari sampel pasien memungkinkan diagnosis virus RNA seperti influenza, virus corona, dan retrovirus.
- Eksperimen pembungkaman gen – Memasukkan siRNA atau miRNA yang disintesis secara artifisial ke dalam sel dapat menurunkan mRNA target, menekan gen tertentu. Ekstraksi RNA memverifikasi knockdown.
- Studi struktur dan fungsi RNA – Mengekstraksi RNA utuh diperlukan untuk mempelajari pelipatan RNA, modifikasi, interaksi, dan aktivitas enzimatik.
- Profil ekspresi gen – Pengumpulan semua RNA dalam sel adalah transkriptomenya. Menganalisis transkriptom memberikan wawasan tentang regulasi gen global.
Perbedaan utama antara RNA dan DNA mempengaruhi ekstraksi
Meskipun keduanya merupakan asam nukleat, RNA dan DNA memiliki perbedaan penting yang memerlukan perbedaan dalam metodologi ekstraksinya:
1. RNA secara kimia kurang stabil daripada DNA
- Gula ribosa dalam RNA mengandung gugus hidroksil (-OH) terlampir di 2′ posisi. Hal ini membuat tulang punggung fosfodiester lebih rentan terhadap hidrolisis spontan.
- RNA juga mudah terdegradasi oleh ribonuklease (RNase) enzim. RNases stabil dan sulit didenaturasi, dan jumlah yang sangat kecil dengan cepat memecah RNA.
- Sebaliknya, DNA tidak memiliki 2′ gugus hidroksil dan tidak ditargetkan oleh RNases. Hal ini membuat DNA lebih stabil dibandingkan RNA secara kimia.
2. PH optimal untuk ekstraksi berbeda
- DNA paling stabil selama ekstraksi pada pH netral atau sedikit basa 7-8.
- Namun, pH di atas 7 mempromosikan hidrolisis basa RNA karena ribosa 2′-OH. Kondisi asam di bawah pH 5 diperlukan untuk RNA.
- Perbedaan pH optimal ini menghadirkan tantangan utama ketika mengekstraksi keduanya secara bersamaan.
3. Kelimpahan seluler dan persyaratan sampel
- Banyak salinan DNA genom hadir dalam setiap sel, memungkinkan jumlah mikrogram mudah diisolasi.
- Kumpulan jenis RNA berbeda yang diekstraksi bergantung pada tingkat ekspresi spesifik jaringan. Jumlah nanogram biasanya diperoleh.
- Dengan demikian, RNA memerlukan penanganan dan pengoptimalan yang lebih hati-hati untuk mengekstraksi jumlah kecil yang ada secara utuh.
Perbandingan langkah demi langkah protokol ekstraksi RNA dan DNA
Dengan mempertimbangkan perbedaan-perbedaan utama tersebut, mari kita periksa pendekatan khusus yang diambil pada setiap langkah ekstraksi RNA dan DNA:
1. Gangguan sampel dan homogenisasi
- Untuk DNA dan RNA, lisis sel pertama-tama diperlukan untuk mengganggu membran dan melepaskan asam nukleat. Metodenya meliputi gangguan fisik dengan menggiling sampel jaringan beku.
- Namun, Inhibitor RNase harus segera ditambahkan ke sampel RNA selama langkah ini untuk menonaktifkan banyak ribonuklease yang dilepaskan. Tidak ada inhibitor yang digunakan untuk DNA.
2. Pemisahan asam nukleat dari komponen seluler
- Untuk ekstraksi DNA, menambahkan larutan garam pekat menyebabkan pengendapan protein sementara meninggalkan DNA terlarut.
- Untuk RNA, garam chaotropic seperti pekat guanidinium isotiosianat dengan cepat mendenaturasi protein sekaligus menonaktifkan RNases.
- Ekstraksi organik dengan fenol dan kloroform membantu memisahkan asam nukleat yang dilepaskan dari protein, lipid, dan karbohidrat untuk DNA dan RNA.
3. Pengendapan dan Pemulihan Asam Nukleat
- Pengendapan etanol atau isopropanol mengisolasi DNA atau RNA dari larutan air. Kondisi yang sedikit asin meningkatkan efisiensi presipitasi RNA.
- Karena jumlah RNA yang sangat kecil, ko-presipitan seperti glikogen atau akrilamida linier digunakan untuk membuat pelet RNA secara visual.
- DNA dengan berat molekul tinggi mudah mengendap sementara RNA tetap larut dalam etanol pada kondisi buffer tertentu. Hal ini memungkinkan pemisahan mereka.
4. Menghilangkan Kontaminan
- Persiapan DNA diperlakukan dengan RNase untuk menghilangkan fragmen RNA yang dimurnikan bersama.
- Juga, Pencernaan DNase bebas RNase menghilangkan jejak DNA dari ekstrak RNA.
- Pemurnian lebih lanjut dapat dilakukan dengan menggunakan kolom putaran, Ekstraksi fenol, atau langkah curah hujan untuk menghilangkan garam, enzim, karbohidrat, dan kontaminan lainnya.
Menilai Kuantitas, Kemurnian, dan Integritas
Kontrol kualitas yang ketat diperlukan untuk memastikan DNA dan RNA yang diekstraksi cocok untuk teknik analitik yang sensitif:
Mengukur Kadar Asam Nukleat
- Penyerapan UV di 260 NM Menggunakan Konsentrasi Perkiraan Spektrofotometer Melalui Hukum Bir-Lambert.
- Kuantitasi fluorometrik menggunakan pewarna seperti SYBR Hijau I lebih sensitif dan akurat daripada absorbansi UV.
Mengevaluasi Kemurnian
- Rasio A260/A280 mendeteksi protein atau kontaminasi fenol. DNA/RNA murni memiliki rasio di sekitar 1.8.
- Rasio panjang gelombang tambahan seperti A260/A230 dapat mendeteksi polisakarida atau kontaminasi chaotropic.
Menilai Integritas RNA
- Elektroforesis mengungkapkan apakah RNA utuh atau terdegradasi. Pita RNA ribosom tajam 28S dan 18S mewakili RNA utuh.
- Nomor Integritas RNA (rin) algoritma secara objektif menilai kualitas RNA dari elektroferogram.
- RNA yang terdegradasi tampak sebagai noda, bukan pita terpisah, dan tidak cocok untuk pengujian hilir.
Kesimpulan
Meskipun ekstraksi DNA dan RNA memiliki beberapa prinsip yang sama, RNA lebih rentan terhadap degradasi dan memerlukan langkah khusus untuk mengisolasinya secara utuh. Memahami perbedaan-perbedaan utama ini memungkinkan para peneliti memperoleh asam nukleat berkualitas tinggi untuk aplikasi hilir yang sensitif. Dengan latihan, protokol ekstraksi dapat disesuaikan untuk RNA dan yang optimal pemurnian DNA dari beragam sumber biologis.
FAQ
Mengapa penghambat RNase diperlukan?
RNases dengan cepat mendegradasi RNA selama ekstraksi. Inhibitor RNase mengikat dan menonaktifkan enzim-enzim ini secara ireversibel, mempertahankan RNA utuh.
Jaringan mana yang terbaik untuk mengekstrak RNA?
RNA berlimpah di jaringan yang aktif secara metabolik seperti hati, ginjal, atau aktif membelah sel. Ini memberikan hasil yang tinggi. Jaringan dengan tingkat RNase tinggi seperti pankreas atau kulit lebih menantang.
Berapa lama RNA dapat disimpan setelah ekstraksi?
RNA yang diisolasi harus disimpan pada suhu -80°C dalam air bebas nuklease. Dalam kondisi ideal, RNA mungkin tetap utuh selama satu tahun tetapi beberapa degradasi masih terjadi seiring berjalannya waktu.
Apakah pilihan alat ekstraksi membuat perbedaan??
Ya, komponen kit seperti buffer lisis dan inhibitor RNase mempengaruhi kualitas RNA. Kit tertentu memiliki kinerja lebih baik untuk aplikasi spesifik seperti pengurutan qPCR atau RNA.
