핵산 추출은 분자 생물학 및 유전학 연구의 기본 기술입니다.. 생물학적 시료에서 DNA와 RNA를 분리하면 유전자 발현 연구를 위한 출발 물질이 제공됩니다., 병원체 검출, 돌연변이 분석, 그리고 훨씬 더. 하지만, DNA와 RNA 구조 및 안정성의 중요한 차이로 인해 각 핵산 유형에 최적화된 특수 추출 프로토콜이 필요합니다..
우리는 왜 하는가? RNA 추출?
RNA는 세포에서 많은 중요한 역할을 수행합니다.. RNA를 추출하는 주요 이유는 다음과 같습니다.:
- 유전자 발현을 연구하기 위해 – 다양한 유전자에서 생산된 RNA의 양은 세포 활동에 대한 통찰력을 제공합니다.. 정량적 RNA 수준 분석 PCR 또는 RNA 염기서열분석을 통해 발달 과정과 세포가 변화하는 조건에 어떻게 반응하는지 이해할 수 있습니다..
- RT-PCR을 수행하려면 – RNA를 추출하면 역전사를 통해 cDNA로 변환될 수 있습니다.. 그런 다음 cDNA를 PCR 증폭 및 분석을 위한 템플릿으로 사용할 수 있습니다..
- 바이러스 검출용 – 바이러스 RNA의 존재는 활성 바이러스 감염을 나타냅니다.. 환자 검체에서 RNA 추출로 인플루엔자 등 RNA 바이러스 진단 가능, 코로나바이러스, 그리고 레트로바이러스.
- 유전자 침묵 실험 – 인공적으로 합성된 siRNA나 miRNA를 세포에 도입하면 표적 mRNA가 분해될 수 있음, 특정 유전자를 억제하는 것. RNA 추출 녹다운을 확인합니다.
- RNA 구조 및 기능 연구 – RNA 접힘을 연구하려면 손상되지 않은 RNA 추출이 필요합니다., 수정, 상호작용, 그리고 효소활동.
- 유전자 발현 프로파일링 – 세포 내 모든 RNA의 집합체는 전사체입니다.. 전사체 분석을 통해 글로벌 유전자 조절에 대한 통찰력 제공.
RNA와 DNA가 추출에 미치는 주요 차이점
둘 다 핵산임에도 불구하고, RNA와 DNA는 추출 방법의 차이를 필요로 하는 중요한 차이점을 가지고 있습니다.:
1. RNA는 DNA보다 화학적으로 덜 안정적입니다.
- RNA의 리보스당에는 수산기가 포함되어 있습니다. (-오) 2에 첨부′ 위치. 이는 포스포디에스테르 골격이 자발적인 가수분해를 더 쉽게 만듭니다..
- RNA는 또한 리보뉴클레아제에 의해 쉽게 분해됩니다. (RNase) 효소. RNase는 안정적이고 변성이 어렵습니다., 매우 적은 양으로도 빠르게 RNA를 단편화합니다..
- 대조적으로, DNA에는 2가 부족하다′ 하이드록실 그룹이며 RNase의 표적이 되지 않습니다.. 이는 화학적으로 DNA를 RNA보다 더 안정하게 만듭니다..
2. 추출을 위한 최적의 pH는 다릅니다
- DNA는 중성 또는 약알칼리성 pH에서 추출하는 동안 가장 안정적입니다. 7-8.
- 하지만, pH 이상 7 리보스 2로 인해 RNA의 알칼리성 가수분해를 촉진합니다.′-오. pH 이하의 산성 조건 5 RNA에 필요하다.
- 최적 pH의 이러한 차이는 두 가지를 동시에 추출할 때 중요한 과제를 제시합니다..
3. 세포 풍부도 및 샘플 요구 사항
- 게놈 DNA의 많은 복사본이 각 세포 내에 존재합니다., 마이크로그램 양을 쉽게 분리할 수 있음.
- 추출된 다양한 RNA 유형의 풀은 조직별 발현 수준에 따라 달라집니다.. 나노그램 양은 일반적으로 얻어집니다.
- 따라서, RNA는 존재하는 미세한 양을 그대로 추출하려면 더욱 주의 깊은 취급과 최적화가 필요합니다..
RNA 및 DNA 추출 프로토콜의 단계별 비교
이러한 주요 차이점을 염두에 두고, RNA 및 DNA 추출의 각 단계에서 취하는 특화된 접근 방식을 살펴보겠습니다.:
1. 시료 파괴 및 균질화
- DNA와 RNA 모두에 대해, 세포막을 파괴하고 핵산을 방출하려면 먼저 세포 용해가 필요합니다.. 방법에는 냉동 조직 샘플을 분쇄하여 물리적인 파괴가 포함됩니다..
- 하지만, 방출된 풍부한 리보뉴클레아제를 비활성화하려면 이 단계에서 RNase 억제제를 RNA 샘플에 즉시 첨가해야 합니다.. DNA에는 억제제가 사용되지 않습니다..
2. 세포 구성요소로부터 핵산 분리
- DNA 추출용, 농축된 염 용액을 첨가하면 DNA가 용해된 상태로 유지되면서 단백질이 침전됩니다..
- RNA의 경우, 농축된 것과 같은 카오트로픽 염 구아니디늄 이소티오시아네이트 단백질을 빠르게 변성시키는 동시에 RNase를 비활성화합니다..
- 페놀과 클로로포름을 이용한 유기 추출은 방출된 핵산을 단백질에서 분리하는 데 도움이 됩니다., 지질, DNA와 RNA 모두에 대한 탄수화물.
3. 핵산의 침전 및 회수
- 에탄올 또는 이소프로판올 침전은 수용액에서 DNA 또는 RNA를 분리합니다.. 약간 염분 조건은 RNA 침전 효율을 향상시킵니다..
- 미세한 RNA 양으로 인해, 글리코겐이나 선형 아크릴아미드와 같은 공침전제는 RNA를 시각적으로 펠릿화하는 데 사용됩니다..
- 특정 완충 조건 하에서 RNA가 에탄올에 용해된 상태로 유지되는 동안 고분자량 DNA는 쉽게 침전됩니다.. 이를 통해 분리가 가능합니다..
4. 오염물질 제거
- DNA 준비물을 RNase로 처리하여 공동 정제된 RNA 단편을 제거합니다..
- 비슷하게, RNase-free DNase 소화는 RNA 추출물에서 미량 DNA를 제거합니다..
- 스핀 컬럼을 사용하여 추가 정제를 수행할 수 있습니다., 페놀 추출, 또는 염분을 제거하기 위한 침전 단계, 효소, 탄수화물, 그리고 다른 오염물질.
수량 평가, 청정, 무결성
추출된 DNA와 RNA가 민감한 분석 기술에 적합한지 확인하려면 엄격한 품질 관리가 필요합니다.:
핵산 수준 정량화
- UV 흡수 260 분광 광도계를 사용하는 nm는 Beer-Lambert 법칙을 통해 농도를 추정합니다..
- 다음과 같은 염료를 사용한 형광 정량 SYBR Green I은 UV 흡광도보다 더 민감하고 정확합니다..
순도 평가
- A260/A280 비율은 단백질 또는 페놀 오염을 감지합니다.. 순수한 DNA/RNA의 비율은 대략 다음과 같습니다. 1.8.
- A260/A230과 같은 추가 파장 비율로 다당류 또는 카오트로픽 오염을 감지할 수 있습니다..
RNA 무결성 평가
- 전기영동을 통해 RNA가 손상되지 않았거나 분해되었는지 확인. 날카로운 28S 및 18S 리보솜 RNA 밴드는 손상되지 않은 RNA를 나타냅니다..
- RNA 무결성 번호 (린) 알고리즘은 전기영동도에서 RNA 품질을 객관적으로 평가합니다..
- 분해된 RNA는 개별 밴드가 아닌 얼룩으로 나타나며 다운스트림 분석에 적합하지 않습니다..
결론
DNA와 RNA 추출은 몇 가지 공통 원칙을 공유하지만, RNA는 분해되기 쉬우며 손상되지 않은 상태로 분리하려면 특정 단계가 필요합니다.. 이러한 주요 차이점을 이해하면 연구자는 민감한 다운스트림 응용 분야를 위한 고품질 핵산을 얻을 수 있습니다.. 연습으로, 추출 프로토콜은 최적의 RNA를 위해 미세 조정될 수 있으며 DNA 정제 다양한 생물학적 소스로부터.
자주 묻는 질문
RNase 억제제가 필요한 이유?
RNase는 추출 중에 RNA를 빠르게 분해합니다.. RNase 억제제는 이러한 효소를 비가역적으로 결합하고 비활성화합니다., 온전한 RNA 보존.
RNA를 추출하기에 가장 좋은 조직은 무엇입니까??
RNA는 간과 같이 대사적으로 활동적인 조직에 풍부합니다., 신장, 또는 적극적으로 세포를 분열시키는 것. 이는 높은 수율을 제공합니다.. 췌장이나 피부와 같이 RNase 수준이 높은 조직은 더 까다롭습니다..
추출 후 RNA를 얼마나 오래 보관할 수 있나요??
분리된 RNA는 뉴클레아제가 없는 물에 -80°C로 보관해야 합니다.. 이상적인 조건에서, RNA는 1년 동안 그대로 유지될 수 있지만 시간이 지남에 따라 일부 분해가 여전히 발생합니다..
추출 키트 선택에 따라 차이가 있나요??
예, 용해 완충액 및 RNase 억제제와 같은 키트 구성 요소는 RNA 품질에 영향을 미칩니다.. 특정 키트는 qPCR 또는 RNA 시퀀싱과 같은 특정 응용 분야에서 더 나은 성능을 발휘합니다..
