核酸抽出は、分子生物学および遺伝学研究における基本的な手法です. 生物学的サンプルからDNAとRNAを分離することは、遺伝子発現を研究するための出発材料を提供します, 病原体の検出, 突然変異の分析, そしてもっと. しかし, DNAとRNAの構造と安定性の重要な違いは、各核酸タイプに最適化された特殊な抽出プロトコルを必要とします.
なぜ私たちをするのですか RNAを抽出します?
RNAは細胞で多くの重要な役割を果たします. RNAを抽出する主な理由はありません:
- 遺伝子発現を研究する – 異なる遺伝子から生成されるRNAの量は、細胞活動に関する洞察を提供します. 定量的にRNAレベルを分析します PCR またはRNAシーケンスにより、発達プロセスと、細胞が変化する状態にどのように反応するかを理解することができます.
- RT-PCRを実行します – RNAを抽出すると、逆転写によってcDNAに変換できます. その後、cDNAはPCR増幅と分析のテンプレートとして使用できます.
- ウイルス検出用 – ウイルスRNAの存在は、活性ウイルス感染を示します. 患者サンプルからRNAを抽出することで、インフルエンザのようなRNAウイルスの診断が可能になります, コロナウイルス, とレトロウイルス.
- 遺伝子サイレンシング実験 – 人工的に合成されたsiRNAまたはmiRNAを細胞に導入すると、標的mRNAを分解する可能性があります, 特定の遺伝子の抑制. RNA抽出 ノックダウンを検証します.
- RNA構造と機能研究 – RNAの折りたたみを研究するには、無傷のRNAを抽出する必要があります, 変更, 相互作用, および酵素活動.
- 遺伝子発現プロファイリング – セル内のすべてのRNAのコレクションはそのトランスクリプトームです. トランスクリプトームを分析すると、グローバルな遺伝子調節に関する洞察が得られます.
RNAとDNAの重要な違いは抽出に影響します
両方とも核酸であるにもかかわらず, RNAとDNAには、抽出方法の違いを必要とする重要な区別があります:
1. RNAは、DNAよりも化学的に安定性が低くなっています
- RNAのリボース糖には、ヒドロキシル基が含まれています (-おお) 2で添付されています′ 位置. これにより、ホスホジエステルのバックボーンは自発的な加水分解傾向になります.
- また、RNAはリボヌクレアーゼによって容易に分解されます (RNase) 酵素. RNaseは安定しており、変性が困難です, そして、非常に少量はRNAを急速に断片化します.
- 対照的に, DNAには2がありません′ ヒドロキシル基であり、RNaseによる標的はありません. これにより、RNAよりもDNAが化学的に安定します.
2. 抽出に最適なpHは異なります
- DNAは、中性またはわずかにアルカリ性のpHでの抽出中に最も安定しています 7-8.
- しかし, 上のpH 7 リボース2によるRNAのアルカリ加水分解を促進する′-おお. pH未満の酸性条件 5 RNAには必要です.
- 最適なpHのこの違いは、両方を同時に抽出するときに重要な課題を提示します.
3. 細胞の豊富さとサンプル要件
- ゲノムDNAの多くのコピーが各細胞内に存在します, マイクログラム量を容易に分離できるようにします.
- 抽出されたさまざまなRNAタイプのプールは、組織固有の発現レベルに依存します. 通常、ナノグラム量が得られます.
- したがって, RNAには、瞬間的な量をそのまま抽出するために、より慎重な取り扱いと最適化が必要です.
RNAおよびDNA抽出プロトコルの段階的な比較
これらの重要な違いを念頭に置いて, RNAおよびDNA抽出の各ステップで取られた特殊なアプローチを調べましょう:
1. サンプルの破壊と均質化
- DNAとRNAの両方, 細胞溶解は、膜を破壊し、核酸を放出するために最初に必要です. 方法には、凍結組織サンプルを粉砕することによる物理的破壊が含まれます.
- しかし, このステップ中にRNase阻害剤をRNAサンプルにすぐに追加する必要があります。. DNAには阻害剤は使用されません.
2. 細胞成分からの核酸の分離
- DNA抽出用, 濃縮塩溶液を添加すると、DNAの可溶化のままになりながらタンパク質の沈殿を引き起こす.
- RNA用, 濃縮のようなカオトロピック塩 グアニジニウムイソチオシアネート RNaseも不活性化しながら、タンパク質を急速に変性させます.
- フェノールとクロロホルムによる有機抽出は、放出された核酸をタンパク質から分離するのに役立ちます, 脂質, DNAとRNAの両方の炭水化物.
3. 核酸の沈殿と回復
- エタノールまたはイソプロパノール沈殿分離分離水溶液からのDNAまたはRNA. わずかに塩辛い状態は、RNA沈殿効率を改善します.
- 微小RNA量のため, グリコーゲンや線形のアクリルアミドなどの共生剤は、視覚的にペレットRNAに使用されます.
- 高分子量DNAは容易に沈殿しますが、RNAは特定のバッファー条件下でエタノールで溶解したままです. これにより、彼らの分離が可能になります.
4. 汚染物質の除去
- DNA準備はRNaseで処理され、共精製RNAフラグメントを除去する.
- 同じく, RNaseを含まないDNase消化は、RNA抽出物からTRACE DNAを排除します.
- スピンカラムを使用してさらに精製することができます, フェノール抽出, または塩を排除するための降水手順, 酵素, 炭水化物, その他の汚染物質.
数量の評価, 純度, と誠実さ
抽出されたDNAとRNAが機密分析技術に適していることを確認するためには、厳密な品質制御が必要です:
核酸レベルの定量化
- UV吸収 260 分光光度計を使用するNMは、ビールランバート法を介して濃度を推定します.
- 染料を使用した蛍光定量 SYBR 緑私はUV吸光度よりも敏感で正確です.
純度の評価
- A260/A280比は、タンパク質またはフェノール汚染を検出します. 純粋なDNA/RNAの比率は周りにあります 1.8.
- A260/A230のような追加の波長比は、多糖またはカオトロピック汚染を検出できます.
RNAの完全性の評価
- 電気泳動は、RNAが無傷であるか分解されているかどうかを明らかにします. シャープ28Sおよび18SリボソームRNAバンドは無傷のRNAを表します.
- RNAの整合性数 (rin) アルゴリズムは、電気測定値からRNA品質を客観的にスコアリングします.
- 分解されたRNAは、個別のバンドではなくスミアとして表示され、ダウンストリームアッセイには適していません.
結論
一方、DNAおよびRNA抽出はいくつかの共通の原則を共有しています, RNAは劣化する傾向があり、それを無傷で隔離するために特定のステップが必要です. これらの重要な違いを理解することで、研究者は高品質の核酸を得ることができます。. 練習で, 抽出プロトコルは、最適なRNAのために微調整できます DNA精製 多様な生物学的源から.
よくある質問
RNase阻害剤が必要なのはなぜですか?
RNaseは抽出中にRNAを急速に分解します. RNase阻害剤は、これらの酵素を不可逆的に結合して不活性化します, 無傷のRNAの保存.
RNAを抽出するのに最適な組織は何ですか?
RNAは肝臓のような代謝的に活性な組織に豊富です, 腎臓, または積極的に分割する細胞. これらは高収量を提供します. 膵臓や皮膚のような高いRNaseレベルの組織はより困難です.
抽出後、RNAはどのくらいの期間保存できますか?
分離されたRNAは、ヌクレアーゼを含まない水に-80°Cで保存する必要があります. 理想的な条件下で, RNAは1年間そのままのままかもしれませんが、時間の経過とともにいくらかの劣化が起こる可能性があります.
抽出キットの選択は違いを生みますか?
はい, 溶解バッファーやRNase阻害剤などのキットコンポーネントはRNA品質に影響します. 特定のキットは、QPCRやRNAシーケンスなどの特定のアプリケーションに対してパフォーマンスが向上します.
