Протеиназа К является важным фермент используется в лабораториях молекулярной биологии для переваривания и удаления белков из препаратов нуклеиновых кислот.. Этот протеолитический фермент обладает ключевыми свойствами, которые делают его исключительно полезным для исследовательских целей.. В этом посте, мы узнаем, что такое протеиназа К, как это работает, и его многочисленные применения в лаборатории.
Что такое протеиназа К?
Протеиназа К представляет собой сериновую протеазу широкого спектра действия, выделенную из гриба Tritirachium album.. Он может быстро переваривать белки на более мелкие пептидные фрагменты и аминокислоты..
Имя «протеиназа К» происходит от его способности переваривать кератин, прочный структурный белок, содержащийся в волосах, гвозди, перья, и т. д.. Гриб Tritirachium album секретирует протеиназу К, когда кератин является единственным источником азота..
Каковы факты о протеиназе К??
Некоторые ключевые факты о протеиназе К:
- Классификация: Принадлежит к семейству пептидаз S8. (семейство субтилизинов)
- Каталитический тип: Сериновая протеаза
- Оптимальный pH:5 — 12.0
- Оптимальная температура:50°С — 65°С
- Молекулярная масса:28,930 И
Протеиназа К содержит каталитическую триаду из трех аминокислот. — аспартат, гистидин, и серин. Серин действует как нуклеофил, расщепляющий пептидные связи.. Ионы кальция важны для полной ферментативной активности..
Как работает протеиназа К?
В качестве сериновой протеазы, протеиназа К катализирует гидролиз пептидных связей, прилегающих к карбоксильной группе алифатических и ароматических аминокислот..
Механизм его действия аналогичен механизму действия других сериновых протеаз, таких как химотрипсин и трипсин.. Вот ключевые шаги:
- Каталитический серин фермента инициирует нуклеофильную атаку карбонильного углерода пептидной связи..
- При этом образуется тетраэдрический промежуточный продукт, стабилизированный водородными связями..
- Затем связь азот-углерод разрывается., высвобождение первого продукта и образование промежуточного ацил-фермента.
- Молекула воды дезактивирует фермент, выпуск второго продукта.
- Это регенерирует активный сериновый центр для следующего раунда катализа..
Протеиназа К расщепляет белки по внутренним пептидным связям как эндопептидаза.. Он не обладает строгой специфичностью, но предпочитает крупные гидрофобные остатки.. Это позволяет ему быстро расщеплять большинство белков на более мелкие фрагменты..
Для чего используется протеиназа К?
Протеиназа К стала важным реагентом для исследований в области молекулярной биологии.. Вот некоторые из наиболее распространенных применений:
Переваривание загрязняющих белков
При выделении ДНК или РНК из клеток и тканей, протеиназа К используется для расщепления загрязняющих белков. Это удаляет примеси из препаратов нуклеиновых кислот.. Добавление моющих средств, таких как Паспорт безопасности помогает раскрыть белки для улучшения пищеварения.
Инактивация нуклеаз
Многие нуклеазы, способные разрушать ДНК и РНК, сами являются белками.. Протеиназа К быстро инактивирует эти вредные нуклеазы путем протеолитического расщепления.. Это защищает изолированные нуклеиновые кислоты от деградации..
Тканевое пищеварение
Протеиназа К может помочь диссоциировать клетки и солюбилизировать ткани., высвобождение нуклеиновых кислот для экстракции. Он включен в буферы для лизиса тканей для протоколов очистки ДНК/РНК..
Анализ белка
Протеаза производит специфические пептидные фрагменты, которые предоставляют информацию о структуре белка.. Модели переваривания протеиназы К полезны для изучения белковых доменов., сайты модификации, и т. д..
Инактивация инфекционных прионов
В качестве эндопептидазы, протеиназа К может переваривать неправильно свернутые прионные белки, ответственные за трансмиссивные губчатые энцефалопатии, такие как болезнь Крейтцфельдта-Якоба.. Его используют для инактивации прионного загрязнения..
Секвенирование ДНК
Некоторые методы секвенирования ДНК используют протеиназу К для удаления ДНК-полимеразы после расширения последовательности., подготовка ДНК к электрофорезу.
Гибридизация in situ
Фермент может мягко проникать в фиксированные клетки/ткани для гибридизации нуклеотидных зондов, сохраняя при этом целостность РНК и ДНК..
Какие условия требует протеиназа К??
Ниже приведены условия, необходимые протеиназе К для правильного функционирования..
Температура
Протеиназа К проявляет высокую активность при температуре от 50°С до 65°С., оптимальная температура около 60°C.. Он сохраняет некоторую протеолитическую способность даже при 37°C.. Более высокие температуры, вероятно, сделают белковые структуры более доступными.
рН
Этот фермент действует в широком диапазоне pH от pH 4 к pH 12, с максимальной активностью между pH 7.5 и 12. Щелочная среда лучше всего, но нейтральный pH тоже работает хорошо.
Моющие средства
Добавление ионных моющих средств, таких как SDS. (додецилсульфат натрия) может повышать активность протеиназы К за счет денатурации белковых субстратов. Неионогенные моющие средства, такие как Тритон Х-100 тоже работаю.
Двухвалентные катионы
Протеиназе К необходимы ионы кальция для полной ферментативной активности и стабильности.. ЭДТА хелатирует кальций и может ингибировать фермент.. Однако, протеиназа К все еще сохраняет некоторые функции без кальция.
Как протеиназа К используется в лаборатории?
Протеиназа К выполняет важные функции в лаборатории и используется в лаборатории следующими способами.:
Рецепт буфера протеиназы К
Типичный буфер для расщепления протеиназой К содержит:
- 10 мм Трис-HCl рН 8.0
- 100 мМ NaCl
- 5% Паспорт безопасности
- 50 мкг/мл протеиназа К
Трис поддерживает щелочной уровень pH около 8.0. NaCl обеспечивает некоторую ионную силу.. SDS денатурирует белки для пищеварения. Буфер может быть изменен по мере необходимости..
Протокол пищеварения
- Добавьте протеиназу К в буфер непосредственно перед использованием..
- Инкубируйте образцы в буфере для 30 минута до 2 часов при температуре от 50°C до 65°C.
- Инактивируйте протеиназу К нагреванием при 95°C в течение 10 мин или с использованием PMSF.
Более длительное переваривание или более высокая температура могут повысить активность.. Контекст выборки диктует оптимальные условия.
Осторожность!
Протеиназа К – очень мощная протеаза.. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать загрязнения образцов или разрушения белков, предназначенных для анализа.. Всегда надевайте перчатки и используйте специальные расходные материалы..
Как инактивируется протеиназа К?
Как только протеиназа К выполнила свою задачу, его необходимо инактивировать, чтобы остановить дальнейшее пищеварение. Вот некоторые методы:
- Обогрев: Температура выше 90°C быстро инактивирует фермент.. Однако, нагревание не полностью устраняет остаточную активность.
- ПМСФ: Этот необратимый ингибитор сериновой протеазы ковалентно модифицирует каталитический серин., постоянная блокировка активности.
- АЕБСФ: Еще один ингибитор сериновой протеазы, который навсегда инактивирует протеиназу К..
- ТСА: Трихлоруксусная кислота денатурирует и осаждает фермент..
Отопление – самый удобный способ, но ингибиторы сериновых протеаз обеспечивают полную инактивацию.
Каковы некоторые альтернативы протеиназе К??
Некоторые альтернативы протеиназы К включают:
- Проназа: Смесь неспецифических протеаз, выделенных из Streptomyces griseus..
- Трипсин: Сериновая протеаза, специфичная к лизину и аргинину..
- Пепсин: Аспарагиновая протеаза из желудочного сока млекопитающих.. Лучше всего работает в кислых условиях.
- Папаин: Цистеиновая протеаза из папайи. Часто используется для диссоциации клеток..
Каждый из них в некоторой степени перекрывается с протеиназой К при деградации белков., но их специфические свойства различаются. Протеиназа К по-прежнему наиболее широко используется в общих лабораторных целях..
Заключение
Мощная сериновая протеиназа К незаменима для молекулярно-биологических исследований и диагностики.. Его замечательная способность быстро переваривать белки, сохраняя при этом активность в суровых условиях, делает его незаменимым ферментом для удаления загрязняющих белков и защиты нуклеиновых кислот..
Понимание того, что такое протеиназа К, как это работает, оптимальные условия работы позволяют исследователям полностью использовать его потенциал в лаборатории.. Эта универсальная протеаза продолжает использовать бесчисленные методы, устраняя мешающие белки и инактивируя вредные нуклеазы для восстановления ДНК и РНК высочайшей чистоты..
