La proteinasa K es importante enzima Utilizado en laboratorios de biología molecular para digerir y eliminar proteínas de preparaciones de ácido nucleico. Esta enzima proteolítica tiene propiedades clave que la hacen excepcionalmente útil para aplicaciones de investigación. En esta publicación, Exploraremos qué es exactamente la proteinasa K, Cómo funciona, y sus muchos usos en el laboratorio.
¿Qué es la proteinasa K??
La proteinasa K es una serina proteasa de amplio espectro aislada del álbum de hongo Tritirachium. Puede digerir rápidamente las proteínas en fragmentos de péptidos más pequeños y aminoácidos.
El nombre “proteinasa k” proviene de su capacidad para digerir queratina, una proteína estructural dura que se encuentra en el cabello, clavos, plumas, etc.. El álbum de hongo Tritirachium secreta la proteinasa K cuando la queratina se proporciona como su única fuente de nitrógeno.
¿Cuáles son los hechos sobre la proteinasa K??
Algunos hechos clave sobre la proteinasa K:
- Clasificación: Pertenece a la familia peptidasa S8 (familia subtilisina)
- Tipo catalítico: Serina proteasa
- PH óptimo:5 – 12.0
- Temperatura óptima:50°C – 65°C
- Peso molecular:28,930 Y
La proteinasa K contiene una tríada catalítica de tres aminoácidos – aspartido, histidina, y serina. La serina actúa como un nucleófilo que escinde enlaces péptidos. Los iones de calcio son importantes para la actividad enzimática completa.
¿Cómo funciona la proteinasa K??
Como una serina proteasa, La proteinasa K cataliza la hidrólisis de enlaces péptidos adyacentes al grupo carboxílico de aminoácidos alifáticos y aromáticos.
Su mecanismo de acción se asemeja al de otras serina proteasas como la quimotripsina y la tripsina. Aquí están los pasos clave:
- La serina catalítica de la enzima inicia un ataque nucleofílico en el enlace péptido carbonilo carbono.
- Esto forma un intermedio tetraédrico estabilizado por enlaces de hidrógeno.
- El enlace de nitrógeno-carbono se rompe, Liberar el primer producto y formar un intermedio de acil-enzima.
- Una molécula de agua desactiva la enzima, Liberando el segundo producto.
- Esto regenera el sitio de serina activo para otra ronda de catálisis..
La proteinasa K escinde las proteínas en los enlaces de péptidos interiores como endopeptidasa. No tiene una especificidad estricta, pero prefiere grandes residuos hidrófobos. Esto le permite descomponer rápidamente la mayoría de las proteínas en fragmentos más pequeños..
¿Para qué se usa la proteinasa K??
La proteinasa K se ha convertido en un reactivo esencial para la investigación de biología molecular. Estos son algunos de sus usos más comunes:
Digerir proteínas contaminantes
Al aislar el ADN o el ARN de las células y los tejidos, La proteinasa K se usa para digerir proteínas contaminantes. Esto elimina las impurezas de las preparaciones de ácido nucleico. Agregar detergentes como Ficha de datos de seguridad (MSDS) Ayuda a exponer proteínas para una digestión mejorada.
Nucleasas inactivadoras
Muchas nucleasas que pueden degradar el ADN y el ARN son proteínas mismas. La proteinasa K inactiva rápidamente estas nucleasas dañinas por escisión proteolítica. Esto protege los ácidos nucleicos aislados de la degradación.
Digestión de tejidos
La proteinasa K puede ayudar a disociar las células y solubilizar los tejidos, liberar ácidos nucleicos para la extracción. Se incluye en tampones de lisis de tejidos para protocolos de purificación de ADN/ARN.
Análisis de proteínas
La proteasa produce fragmentos de péptidos específicos que proporcionan información sobre la estructura de proteínas. Los patrones de digestión con proteinasa K son útiles para estudiar dominios de proteínas, Sitios de modificación, etc..
Inactivando priones infecciosos
Como endopeptidasa, La proteinasa K puede digerir las proteínas priones mal plegadas responsables de las encefalopatías espongiformes transmisibles como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. Se usa para inactivar la contaminación por priones.
Secuenciación de ADN
Algunos métodos de secuenciación de ADN usan proteinasa K para eliminar la ADN polimerasa después de la extensión de la secuencia, Preparación del ADN para la electroforesis.
Hibridación in situ
La enzima puede permeabilizar suavemente las células/tejido fijos para la hibridación de las sondas de nucleótidos al tiempo que preserva el ARN y la integridad del ADN.
¿Qué condiciones requieren la proteinasa K??
Las siguientes son las condiciones que la proteinasa K requiere para funcionar correctamente.
Temperatura
La proteinasa K exhibe una alta actividad de 50 ° C a 65 ° C, con una temperatura óptima de alrededor de 60 ° C. Conserva cierta capacidad proteolítica incluso a 37 ° C. Las temperaturas más altas probablemente hacen que las estructuras de proteínas sean más accesibles.
pH
Esta enzima funciona en un amplio rango de pH desde el pH 4 a ph 12, con máxima actividad entre pH 7.5 y 12. Las condiciones alcalinas son las mejores, Pero el pH neutral también funciona bien.
Detergentes
Agregar detergentes iónicos como SDS (dodecil sulfato de sodio) puede mejorar la actividad de la proteinasa K al desnaturalizar los sustratos de proteínas. Detergentes no iónicos como Tritón X-100 también trabajar.
Cationes divalentes
La proteinasa K requiere iones de calcio para la actividad enzimática completa y la estabilidad. EDTA quelata el calcio y puede inhibir la enzima. Sin embargo, La proteinasa K todavía conserva alguna función sin calcio.
¿Cómo se usa la proteinasa K en el laboratorio??
La proteinasa K tiene funciones importantes en el laboratorio y se usa en el laboratorio de las siguientes maneras:
Receta de tampón proteinasa K
Un tampón típico de digestión de proteinasa K contiene:
- 10 milímetro Tris-HCl pH 8.0
- 100 mm NaCl
- 5% Ficha de datos de seguridad (MSDS)
- 50 μg/ml de proteinasa k
El tris mantiene un pH alcalino de alrededor 8.0. NaCl proporciona cierta fuerza iónica. Proteínas SDS para la digestión. El búfer se puede modificar según sea necesario.
Protocolo de digestión
- Agregue la proteinasa K al tampón justo antes de usar.
- Incubar muestras en el búfer para 30 mínimo 2 HRS a 50 ° C a 65 ° C.
- Inactivar la proteinasa K calentando a 95 ° C para 10 min o usar PMSF.
Las digestiones más largas o una temperatura más alta pueden aumentar la actividad. El contexto de la muestra dicta condiciones óptimas.
Precaución!
La proteinasa K es una proteasa muy potente. Se debe tener cuidado para evitar muestras de contaminación o proteínas degradantes destinadas a analizarse. Siempre use guantes y use suministros dedicados.
¿Cómo se inactiva la proteinasa K??
Una vez que la proteinasa K ha cumplido su propósito, debe inactivarse para detener más digestión. Aquí hay algunos métodos:
- Calefacción: Las temperaturas superiores a 90 ° C inactivan rápidamente la enzima. Sin embargo, El calentamiento no elimina completamente la actividad residual.
- PMSF: Este inhibidor de serina proteasa irreversible modifica covalentemente la serina catalítica, Actividad de bloqueo permanente.
- Aebsf: Otro inhibidor de la serina proteasa que inactiva permanentemente la proteinasa K.
- TCA: Denaturas de ácido tricloroacético y precipita la enzima.
La calefacción es el método más conveniente, Pero los inhibidores de la serina proteasa proporcionan inactivación completa.
¿Cuáles son algunas alternativas a la proteinasa K??
Algunas alternativas de la proteinasa K incluyen:
- Pronasa: Una mezcla de proteasa inespecífica aislada de Streptomyces Griseus.
- Tripsina: Una serina proteasa con especificidad para la lisina y la arginina.
- Pepsina: Una proteasa aspártica del jugo gástrico de mamíferos. Funciona mejor en condiciones ácidas.
- Papaína: Una cisteína proteasa de la papaya. A menudo utilizado para la disociación celular.
Cada uno tiene cierta superposición con la proteinasa K en las proteínas degradantes, Pero sus propiedades específicas difieren. La proteinasa K sigue siendo la más utilizada para fines de laboratorio generales.
Conclusión
La potente serina proteasa proteinasa K es indispensable para la investigación y el diagnóstico de la biología molecular. Su notable capacidad para digerir rápidamente las proteínas mientras se mantiene activa en condiciones duras lo convierte en la enzima para eliminar proteínas contaminantes y proteger los ácidos nucleicos.
Comprender qué es la proteinasa K, Cómo funciona, y sus condiciones de trabajo óptimas permiten a los investigadores aprovechar todo su potencial en el laboratorio. Esta proteasa versátil continúa permitiendo innumerables técnicas al eliminar las proteínas interferentes e inactivar nucleasas dañinas para recuperar el ADN y el ARN de la mayor pureza.
