蛋白酶K是重要的 酶 用於分子生物學實驗室，用於消化和去除核酸製劑中的蛋白質. 該蛋白水解酶具有關鍵特性，使其對研究應用非常有用. 在這篇文章中, 我們將探索什麼是蛋白酶K, 它如何運作, 它在實驗室中的許多用途.
什麼是蛋白酶K?
蛋白酶K是一種從真菌Tritirachium專輯中分離出的廣譜絲氨酸蛋白酶. 它可以快速消化蛋白質成較小的肽片段和氨基酸.
名字 “蛋白酶K。” 來自其消化角蛋白的能力, 頭髮中發現的堅硬結構蛋白, 指甲, 羽毛, ETC. 真菌Tritirachium專輯分泌蛋白酶K時，將角蛋白作為其唯一的氮源提供.
蛋白酶K的事實是什麼?
關於蛋白酶K的一些關鍵事實:
- 分類: 屬於肽酶家族S8 (枯草菌家族)
- 催化類型: 絲氨酸蛋白酶
- 最佳pH:5 – 12.0
- 最佳溫度:50℃ – 65℃
- 分子量:28,930 和
蛋白酶K含有三種氨基酸的催化三合會 – 天冬氨酸, 組氨酸, 和絲氨酸. 絲氨酸充當裂解肽鍵的親核試劑. 鈣離子對於完全酶活性很重要.
蛋白酶K如何工作?
作為絲氨酸蛋白酶, 蛋白酶K催化與脂肪族和芳香族氨基酸羧基相鄰的肽鍵的水解.
它的作用機理類似於其他絲氨酸蛋白酶（如辣椒蛋白酶和胰蛋白酶）. 這是關鍵步驟:
- 酶的催化絲氨酸引發了對肽鍵羰基碳的親核攻擊.
- 這形成了四面體的中間體通過氫鍵穩定.
- 然後，氮氣鍵斷裂, 釋放第一個產品並形成酰基酶中間體.
- 水分子停用酶, 釋放第二種產品.
- 這為另一輪催化的活性絲氨酸位點再生.
蛋白酶K將蛋白質切割為內肽酶的內部肽鍵. 它沒有嚴格的特異性，但更喜歡大疏水殘基. 這使其可以迅速將大多數蛋白質分解為較小的片段.
什麼是蛋白酶K用於?
蛋白酶K已成為分子生物學研究的重要試劑. 這是其最常見的用途:
消化污染蛋白
從細胞和組織分離DNA或RNA時, 蛋白酶K用於消化污染蛋白. 這消除了核酸製劑中的雜質. 添加清潔劑 安全資料表 有助於暴露蛋白質以增強消化.
滅活核酸酶
許多可以降解DNA和RNA的核酸酶本身就是蛋白. 蛋白酶K迅速通過蛋白水解裂解迅速失活這些有害核酸酶. 這可以保護分離的核酸免受降解.
組織消化
蛋白酶K可以幫助解離細胞並溶解組織, 釋放核酸提取. 它包含在DNA/RNA純化方案的組織裂解緩衝液中.
蛋白質分析
蛋白酶產生特定的肽片段，可提供有關蛋白質結構的信息. 蛋白酶K消化模式可用於研究蛋白質結構域, 修改站點, ETC.
失活的傳染病
作為內肽酶, 蛋白酶K可以消化負責傳播的海綿狀腦病等錯誤折疊的prion蛋白. 它用來滅活王室污染.
DNA測序
一些DNA測序方法使用蛋白酶K去除序列後去除DNA聚合酶, 為電泳準備DNA.
原位雜交
該酶可以輕輕地透明固定細胞/組織進行核苷酸探針的雜交，同時保留RNA和DNA完整性.
蛋白酶K需要什麼條件?
以下是蛋白酶K需要正常運行的條件.
溫度
蛋白酶K從50°C到65°C表現出較高的活性, 最佳溫度約為60°C. 它即使在37°C下仍保留一些蛋白水解能力. 較高的溫度可能使蛋白質結構更容易獲得.
酸鹼度
該酶在pH的較寬pH範圍內起作用 4 ph 12, pH之間的最大活性 7.5 和 12. 鹼性狀況最好, 但是中性pH也很好.
洗滌劑
添加離子洗滌劑等SDS (十二烷基硫酸鈉) 可以通過貶低蛋白質底物來增強蛋白酶K活性. 非離子洗滌劑 海衛一 X-100 也有效.
二價陽離子
蛋白酶K需要鈣離子以進行全酶活性和穩定性. EDTA螯合鈣並可以抑制酶. 然而, 蛋白酶K仍然保留某些功能而沒有鈣.
實驗室中如何使用蛋白酶K?
蛋白酶K在實驗室中具有重要功能，並以以下方式在實驗室中使用:
蛋白酶K緩衝液配方
典型的蛋白酶K消化緩衝液包含:
- 10 毫米 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 酸鹼度 8.0
- 100 毫摩爾氯化鈉
- 5% 安全資料表
- 50 μg/ml蛋白酶K
Tris保持鹼性pH值 8.0. NaCl提供了一些離子強度. SDS DENATUS蛋白質用於消化. 可以根據需要修改緩衝區.
消化協議
- 使用前，將蛋白酶K添加到緩衝液中.
- 在緩衝液中孵化樣品 30 最小到 2 HRS在50°C至65°C下.
- 通過在95°C加熱的蛋白酶K滅活蛋白酶K 10 最小或使用PMSF.
較長的消化或更高的溫度可以增加活動. 樣本上下文決定最佳條件.
警告!
蛋白酶K是一種非常有效的蛋白酶. 必須注意避免污染樣品或降解蛋白質的污染. 始終戴手套並使用專用的用品.
蛋白酶K如何滅活?
一旦蛋白酶K達到了目的, 必須滅活以停止進一步的消化. 這是一些方法:
- 加熱: 高於90°C以上的溫度迅速使酶失活. 然而, 加熱不能完全消除殘留活性.
- PMSF: 這種不可逆的絲氨酸蛋白酶抑製劑共價修飾催化絲氨酸, 永久阻止活動.
- aebsf: 另一種永久失活蛋白酶K的絲氨酸蛋白酶抑製劑.
- TCA: 三氯乙酸的含糖並沉澱酶.
加熱是最方便的方法, 但是絲氨酸蛋白酶抑製劑可完全失活.
蛋白酶K的一些選擇是什麼?
蛋白酶K的一些替代方法包括:
- pronase: 從穀物鏈黴菌分離的非特異性蛋白酶混合物.
- 胰蛋白酶: 具有賴氨酸和精氨酸特異性的絲氨酸蛋白酶.
- 胃: 哺乳動物胃汁的天冬氨酸蛋白酶. 在酸性條件下運作最佳.
- 木瓜蛋白酶: 木瓜的半胱氨酸蛋白酶. 通常用於細胞解離.
每個在降解蛋白質中都與蛋白酶K重疊, 但是它們的特定特性不同. 蛋白酶K仍然是最廣泛用於通用實驗室的目的.
結論
強大的絲氨酸蛋白酶蛋白酶K對於分子生物學研究和診斷是必不可少的. 它在惡劣條件下保持活性的同時快速消化蛋白質的顯著能力使其成為去除污染蛋白和保護核酸的首選酶.
了解哪種蛋白酶K是, 它如何運作, 它的最佳工作條件使研究人員能夠在實驗室中發揮其全部潛力. 這種多功能的蛋白酶通過消除乾擾蛋白和滅活有害核酸酶以恢復最高純度的DNA和RNA，繼續實現無數技術.
