Что такое ПЦР Мастер Микс?? смесь qPCR? Как ты это делаешь?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является важным инструментом в молекулярной биологии и диагностике. В основе каждой реакции ПЦР лежит главная смесь — Представленный коктейль, содержащий все ключевые ингредиенты для амплификации ДНК. Но что именно входит в этот важный компонент ПЦР? И какие соображения должны быть разработаны идеальным мастер -миксом для ваших экспериментов? Это всеобъемлющее руководство разбивает все это в простых терминах.

Что такое мастер ПЦР?

А ПЦР Master Mix представлен, готовый к использованию раствор, содержащий все важные компоненты для полимеразной цепной реакции, кроме матрицы ДНК и праймеров. Обычно это включает в себя:

• ДНК -полимеразный фермент
• Дезоксинуклеотиды (дНТФ)
• Реакционный буфер
• Хлорид магния
• Стабилизаторы и усилители

Подготовленным мастер -миксом, Вы можете аликвовать одну и ту же оптимизированную формулировку в несколько реакционных труб или скважин пластины. Это экономит время, уменьшает ошибки, и улучшает согласованность по сравнению с добавлением каждого компонента индивидуально к каждой реакции.

Master Mixes-это ПЦР-изменение, Включение упрощенной высокопроизводительной экспериментальной настройки. Вы выполняете рутинные ПЦР или анализируете тысячи образцов, Мастер -микс оптимизирует рабочий процесс.

Какие виды мастер -миксов ПЦР?

Существует много продуктов Master Mix, оптимизированных для различных типов приложений для ПЦР:

• Стандартная ПЦР —Для обычной амплификации ДНК. Содержит полимеразы непофруфинга.
• ПКР высокой точки— Использует корректуру полимеразы для клонирования, последовательность действий, или приложения, требующие высокой точности.
• Мультиплексная ПЦР — Содержит сбалансированные праймеры для совместной амплификации множественных мишеней в одной реакции.
• В реальном времени QPCR — Включает флуоресцентные репортеры, такие как зонды или ДНК -красители для количественной оценки.
• ОТ-ПЦР — Содержит фермент обратной транскриптазы для амплификационных матриц РНК.
• Горячий старт ПЦР — Использование ингибитор-блокированной теплотивированной полимеразы для улучшения специфичности путем снижения ложных продуктов амплификации.
• Быстрая велосипедная ПЦР — Включает быстрые протоколы термоциклирования для увеличения пропускной способности.

Многие основные миксы также предварительно оптимизированы для использования на определенных приборах для ПЦР или химии обнаружения, таких как зонды такмана. Так что сопоставьте специализированную смесь с вашим конкретным протоколом ПЦР, цели, и платформа для лучших результатов.

QPCR Master Mix для экспериментов в реальном времени

Для количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР) эксперименты, Специализированные мастер -смеси QPCR содержат флуоресцентно меченные зонды или ДНК -связывающие красители, чтобы обеспечить обнаружение и количественное определение продуктов ПЦР, когда они накапливаются в «в реальном времени» во время термоциклирования.

Некоторые общие типы мастер-миксов в реальном времени включают:

• СИБР Зеленый — Интеркалирующее краситель, который флуоресцирует, когда связывается с двухцепочечной ДНК.
• Такман -зонд — Флуорофорные зонды, расщепленные во время усиления.
• Молекулярный маяк — Флуоресцентные датчики шпильки с гасителем, чтобы уменьшить фон.
• Гибридизационный зонд — На основе смежных зондов для генерации сигналов для генерации сигналов.

Использование мастер -смеси, сформулированное и оптимизированное для вашей конкретной химии обнаружения QPCR, упрощает настройку реакции и обеспечивает надежную, Чувствительные результаты.

Как сделать мастер ПЦР?

В то время как высококачественные коммерческие продукты Master Mix широко доступны, Вы также можете сделать свой собственный Master Mix. Вот ключевые шаги.:

1. Выберите фермент ДНК -полимеразы

Это самый важный компонент, который катализирует амплификацию ДНК. Популярные варианты включают TAQ, ПФУ, Q5, Утечка, КОД, Тт. Рассмотрим процессивность, точность, скорость расширения, и совместимость с буферами ПЦР при выборе фермента.

2. Подготовьте оптимизированный буфер реакции ПЦР

Буфер обеспечивает идеальный pH, концентрации соли, и совместимость кофакторов для полимеразной активности. Общие компоненты:

• Трис-HCl рН 8.5 — Поддерживает нейтральный рН при температуре удлинения
• Kcl или (Th4)2SO4 — Моновалентные катионы для проводимости
• MgCl2 — Essential Divalent Cation Cofactor для полимеразы
• Усильники ПЦР — Бетаин, ДМСО, Стабилизаторы, такие как BSA

3. Добавить сбалансированные дезоксинуклеотиды (дНТФ)

Используйте эквимолярную смесь DATP, dCTP, дГТФ, дТТП. Стандартная концентрация 100-200 мкм каждый DNTP.

4. Включите необходимые кофакторы

Хлорид магния (MgCl2) является важным кофактором для полимеразной активности и специфичности. Включить в 1-5 ММ Окончательная концентрация.

5. Добавить стабилизаторы

Неионовые моющие средства, DTT, Трегалоз, и т. д.. помочь поддерживать активность полимеразы во время хранения.

6. Настроить концентрации компонентов

Для удобства, Сделайте концентрированную мастер -смеси в 2 раза или 4x путем удвоения или четырехлетнего количества компонентов.

7. Тщательно перемешать компоненты перед аликвотой

Вихрево энергично или пипетка неоднократно, чтобы обеспечить однородную мастер -микс.

8. Сделайте одноразовые аликвоты для хранения

Избегайте циклов замораживания-оттаивания. Для достижения наилучших результатов, хранить замороженные и аликвоты оттаивания на льду перед использованием.

При первой разработке вашего мастер -микса, Следуйте рецептам буфера и концентрациям компонентов, предложенных производителем полимеразы в качестве отправной точки.

Оптимизировать концентрации с помощью итеративного тестирования, чтобы максимизировать эффективность, специфика, чувствительность, и последовательность вашего конкретного протокола ПЦР, инструмент, и приложение.

Как использовать мастер ПЦР

Использование мастер -смеси ПЦР в ваших реакциях не может быть проще. Вот быстрый пошаговый обзор:

1. Оттаивание — Позвольте охлажденной мастер -смеси полностью на льду.
2. Вихрь — Хорошо перемешайте, вихря или пипетируя вверх и вниз, чтобы обеспечить однородность перед аликвотой.
3. Аликвот — Распределите соответствующий объем мастер -смеси на реакцию в ПЦР -трубки или скважины на основе размера реакции.
4. Добавить праймеры — Пипетка вперед и обратные праймеры в каждую реакционную трубку/лунку.
5. Добавить шаблон — Добавьте образец ДНК или другой шаблон в каждую реакцию.
6. Пополнить — При необходимости, Добавить дополнительную воду с ПЦР, чтобы достичь конечного желаемого объема реакции.
7. Смешивание — Аккуратно вихревой или пипеткой смеси, чтобы объединить все компоненты в каждой реакции.
8. Центрифуга — Кратко вращайте трубки/тарелки, чтобы собрать содержимое внизу.
9. ПЦР — Поместите реакции в термоциклере и запустите свой ПЦР.!

При использовании основного микса, Всегда добавляйте шаблон ДНК в последний раз, После праймеров, Чтобы избежать перекрестного загрязнения между реакциями.

Как PCR Master Mix способствует усилению ДНК?

Мастер ПЦР содержит основные ингредиенты для амплификации ДНК в готовом к использованию формату. Использование основного микса упрощает настройку реакции, уменьшает ошибки, и улучшает последовательность.

Различные типы оптимизированных главных миксов доступны для стандартной ПЦР, кПЦР, ПКР высокой точки, ОТ-ПЦР, и более. Вы также можете сделать свой собственный микс, Но коммерческие продукты предлагают обширные качественные тестирование и удобство.

Понимание PCR Master Mix помогает обеспечить успешные результаты для всех ваших потребностей в усилении. С силой мастер -микса в вашем молекулярной биологии инструментарий, Эксперименты ДНК становится легким.