Reaksi berantai polimerase (PCR) adalah alat penting dalam biologi dan diagnostik molekuler. Di jantung setiap reaksi PCR adalah campuran utama – Koktail premade yang berisi semua bahan utama untuk amplifikasi DNA. Tapi apa yang sebenarnya masuk ke dalam komponen PCR yang penting ini? Dan pertimbangan apa yang harus dilakukan untuk merumuskan campuran master yang sempurna untuk eksperimen Anda? Panduan komprehensif ini memecah semuanya dalam istilah sederhana.
Apa itu campuran master PCR?
A PCR Master Mix adalah premixed, Solusi siap pakai yang mengandung semua komponen penting untuk reaksi berantai polimerase kecuali templat DNA dan primer. Ini biasanya termasuk:
- Enzim DNA polimerase
- Deoksinukleotida (dNTP)
- Buffer reaksi
- Magnesium klorida
- Penstabil dan penambah
Dengan menyiapkan campuran master, Anda dapat alikuot formulasi yang dioptimalkan yang sama ke dalam beberapa tabung reaksi atau sumur pelat. Ini menghemat waktu, mengurangi kesalahan, dan meningkatkan konsistensi dibandingkan dengan menambahkan setiap komponen secara individual ke setiap reaksi.
Campuran master adalah game-changer PCR, Mengaktifkan pengaturan percobaan throughput tinggi yang disederhanakan. Baik Anda melakukan PCR rutin atau menganalisis ribuan sampel, Campuran master merampingkan alur kerja.
Apa jenis campuran master PCR?
Ada banyak produk master campuran yang dioptimalkan untuk berbagai jenis aplikasi PCR:
- PCR standar –Untuk amplifikasi DNA rutin. Berisi polimerase yang tidak tahan lama.
- PCR kesetiaan tinggi– Menggunakan proofreading polimerase untuk kloning, pengurutan, atau aplikasi yang membutuhkan akurasi tinggi.
- PCR multipleks – Berisi primer seimbang untuk menguatkan beberapa target dalam satu reaksi.
- QPCR real-time – Termasuk wartawan neon seperti probe atau pewarna DNA untuk kuantifikasi.
- RT-PCR – Berisi enzim transkriptase terbalik untuk memperkuat templat RNA.
- Hot Start PCR – Menggunakan polimerase teraktivasi panas yang diblokir inhibitor untuk meningkatkan spesifisitas dengan mengurangi produk amplifikasi palsu.
- PCR Bersepeda Cepat – Mengaktifkan protokol termosison yang cepat untuk meningkatkan throughput.
Banyak campuran master juga hadir dioptimalkan untuk digunakan pada instrumen PCR tertentu atau kimia deteksi seperti probe taqman. Jadi cocokkan campuran khusus dengan protokol PCR khusus Anda, target, dan platform untuk hasil terbaik.
QPCR Master Mix untuk Eksperimen Real-Time
Untuk PCR real-time kuantitatif (qPCR) Eksperimen, Campuran master qPCR khusus mengandung probe berlabel fluoresensi atau pewarna pengikat DNA untuk memungkinkan deteksi dan kuantifikasi produk PCR saat mereka menumpuk “waktu nyata” Selama termosison.
Beberapa jenis campuran master qPCR real-time termasuk:
- SYBR Hijau – Interkalasi pewarna yang fluoresces saat terikat ke DNA untai ganda.
- Taqman Probe – Probe fluorophore-quencher terpecah selama amplifikasi.
- Suar molekul – Probe jepit rambut fluorescent dengan quencher untuk mengurangi latar belakang.
- Probe hibridisasi – Probe yang berdekatan berbasis fret untuk pembuatan sinyal.
Menggunakan master mix yang diformulasikan dan dioptimalkan untuk kimia deteksi qPCR khusus Anda menyederhanakan pengaturan reaksi dan memberikan yang dapat diandalkan, hasil sensitif.
Cara membuat campuran master pcr?
Sementara produk master campuran komersial berkualitas tinggi tersedia secara luas, Anda juga dapat membuat campuran master PCR khusus Anda. Inilah langkah -langkah utama yang terlibat:
1. Pilih enzim DNA polimerase
Ini adalah komponen terpenting yang mengkatalisasi amplifikasi DNA. Pilihan populer termasuk Taq, Pfu, Q5, Fusi, KODE, Tth. Pertimbangkan prosestivitas, ketepatan, tingkat ekstensi, dan kompatibilitas dengan buffer PCR saat memilih enzim.
2. Siapkan buffer reaksi PCR yang dioptimalkan
Penyangga memberikan pH yang ideal, konsentrasi garam, dan kompatibilitas kofaktor untuk aktivitas polimerase. Komponen umum adalah:
- Tris-HCl pH 8.5 – Mempertahankan pH netral pada suhu ekstensi
- Kcl atau (Th4)2SO4 – Kation monovalen untuk konduktivitas
- Mgcl2 – Kofaktor kation divalen esensial untuk polimerase
- Penambah PCR – Betaine, DMSO, Penstabil seperti BSA
3. Tambahkan deoxynucleotides seimbang (dNTP)
Gunakan perpaduan equimolar dari datp, DCTP, dGTP, dTTP. Konsentrasi standar adalah 100-200 μm masing -masing Dntp.
4. Sertakan kofaktor penting
Magnesium klorida (Mgcl2) adalah kofaktor penting untuk aktivitas dan spesifisitas polimerase. Termasuk di 1-5 konsentrasi akhir mm.
5. Tambahkan penstabil
Deterjen non-ionik, DTT, trehalose, dll.. membantu mempertahankan aktivitas polimerase selama penyimpanan.
6. Sesuaikan konsentrasi komponen
Untuk kenyamanan, Buat campuran master 2x atau 4x terkonsentrasi dengan menggandakan atau jumlah empat komponen.
7. Campur komponen secara menyeluruh sebelum alikuot
Vortex dengan kuat atau pipet berulang kali untuk memastikan campuran master yang homogen.
8. Buat alikuot sekali pakai untuk penyimpanan
Hindari siklus beku-cair. Untuk hasil terbaik, Simpan alikuot beku dan cair di atas es sebelum digunakan.
Saat pertama kali mengembangkan campuran master Anda, Ikuti resep buffer dan konsentrasi komponen yang disarankan oleh produsen polimerase sebagai titik awal.
Mengoptimalkan konsentrasi melalui pengujian iteratif untuk memaksimalkan efisiensi, kekhususan, kepekaan, dan konsistensi untuk protokol PCR khusus Anda, instrumen, dan aplikasi.
Cara menggunakan campuran master pcr
Menggunakan campuran master PCR dalam reaksi Anda tidak bisa lebih mudah. Berikut gambaran langkah demi langkah cepat:
- Mencair – Biarkan master yang didinginkan mencair sepenuhnya di atas es.
- Pusaran – Aduk rata dengan vortex atau pipetting ke atas dan ke bawah untuk memastikan homogenitas sebelum alikuot.
- Alikuot – Buang volume campuran master yang sesuai per reaksi ke tabung PCR atau sumur pelat berdasarkan ukuran reaksi.
- Tambahkan primer – Pipet ke depan dan membalikkan primer ke dalam setiap tabung reaksi/sumur.
- Tambahkan template – Tambahkan sampel DNA atau templat lain ke setiap reaksi.
- Top up – Jika diperlukan, Tambahkan air PCR-grade tambahan untuk mencapai volume reaksi akhir yang diinginkan.
- Mencampur – Vortex atau campuran pipet dengan lembut untuk menggabungkan semua komponen di setiap reaksi.
- Mesin sentrifugal – Tabung/piring putar singkat untuk mengumpulkan isi di bagian bawah.
- PCR – Tempatkan reaksi dalam pengendara sepeda termal dan mulai menjalankan PCR Anda!
Saat menggunakan campuran master, Selalu tambahkan template DNA terakhir, setelah primer, untuk menghindari kontaminasi silang antara reaksi.
Bagaimana PCR Master Mix Powers DNA Amplifikasi?
Campuran master PCR berisi bahan-bahan penting untuk amplifikasi DNA dalam format siap pakai. Menggunakan master mix menyederhanakan pengaturan reaksi, mengurangi kesalahan, dan meningkatkan konsistensi.
Berbagai jenis campuran master yang dioptimalkan tersedia untuk PCR standar, qPCR, PCR kesetiaan tinggi, RT-PCR, dan banyak lagi. Anda juga dapat membuat campuran khusus Anda sendiri, Tetapi produk komersial menawarkan pengujian dan kenyamanan berkualitas luas.
Memahami PCR Master Mix membantu memastikan hasil yang berhasil untuk semua kebutuhan amplifikasi Anda. Dengan kekuatan campuran master di toolkit biologi molekuler Anda, Eksperimen DNA menjadi mudah.
