La reacción en cadena de la polimerasa. (PCR) Es una herramienta esencial en biología molecular y diagnóstico.. En el corazón de cada reacción de PCR está la mezcla maestra – un cóctel preparado que contiene todos los ingredientes clave para la amplificación del ADN. Pero, ¿qué incluye exactamente este componente crucial de la PCR?? ¿Y qué consideraciones se deben tener en cuenta al formular la mezcla maestra perfecta para sus experimentos?? Esta guía completa lo desglosa todo en términos simples..
¿Qué es una mezcla maestra de PCR??
A Mezcla maestra de PCR es una premezcla, Solución lista para usar que contiene todos los componentes esenciales para la reacción en cadena de la polimerasa, excepto la plantilla de ADN y los cebadores.. Normalmente incluye:
- enzima ADN polimerasa
- Desoxinucleótidos (dNTP)
- Tampón de reacción
- Cloruro de magnesio
- Estabilizadores y potenciadores.
Preparando una mezcla maestra, puede dividir en alícuotas la misma formulación optimizada en varios tubos de reacción o pocillos de una placa. Esto ahorra tiempo, reduce los errores, y mejora la consistencia en comparación con agregar cada componente individualmente a cada reacción.
Las mezclas maestras cambian las reglas del juego en PCR, permitiendo una configuración de experimento simplificada de alto rendimiento. Ya sea que esté realizando PCR de rutina o analizando miles de muestras, una mezcla maestra agiliza el flujo de trabajo.
¿Cuáles son los tipos de PCR Master Mixes??
Hay muchos productos de mezcla maestra optimizados para diferentes tipos de aplicaciones de PCR.:
- PCR estándar –Para amplificación de ADN de rutina. Contiene polimerasas no correctoras..
- PCR de alta fidelidad– Utiliza polimerasas correctoras para la clonación., secuenciación, o aplicaciones que requieren alta precisión.
- PCR múltiplex – Contiene cebadores equilibrados para coamplificar múltiples objetivos en una reacción..
- qPCR en tiempo real – Incluye reporteros fluorescentes como sondas o tintes de ADN para cuantificación..
- RT-PCR – Contiene enzima transcriptasa inversa para amplificar plantillas de ARN..
- PCR de arranque en caliente – Utiliza polimerasa activada por calor bloqueada por inhibidores para mejorar la especificidad al reducir los productos de amplificación espurios..
- PCR de ciclo rápido – Permite protocolos rápidos de termociclado para aumentar el rendimiento.
Muchas mezclas maestras también vienen preoptimizadas para su uso en ciertos instrumentos de PCR o químicas de detección como las sondas TaqMan.. Así que combine la mezcla especializada con su protocolo de PCR particular, objetivos, y plataforma para los mejores resultados.
Mezcla maestra de qPCR para experimentos en tiempo real
Para PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) experimentos, Las mezclas maestras especializadas de qPCR contienen sondas marcadas con fluorescencia o colorantes de unión al ADN para permitir la detección y cuantificación de los productos de PCR a medida que se acumulan en “en tiempo real” durante el termociclado.
Algunos tipos comunes de mezcla maestra de qPCR en tiempo real incluyen:
- SIBR Verde – Colorante intercalante que emite fluorescencia cuando se une al ADN bicatenario..
- Sonda TaqMan – Sondas de fluoróforo extintor escindidas durante la amplificación.
- baliza molecular – Sondas fluorescentes en forma de horquilla con un extintor para reducir el fondo.
- Sonda de hibridación – Sondas adyacentes basadas en FRET para generación de señales.
El uso de una mezcla maestra formulada y optimizada para su química de detección de qPCR particular simplifica la configuración de la reacción y proporciona resultados confiables., resultados sensibles.
Cómo hacer una mezcla maestra de PCR?
Si bien los productos comerciales de mezcla maestra de alta calidad están ampliamente disponibles, También puede crear su mezcla maestra de PCR personalizada. Estos son los pasos clave a seguir:
1. Elija una enzima ADN polimerasa
Este es el componente más importante que cataliza la amplificación del ADN.. Las opciones populares incluyen Taq, fuf, Q5, Fusión, CÓDIGO, Enésima. Considere la procesividad, exactitud, tasa de extensión, y compatibilidad con tampones de PCR al seleccionar una enzima.
2. Prepare el tampón de reacción de PCR optimizado
El tampón proporciona un pH ideal, concentraciones de sal, y compatibilidad de cofactores para la actividad polimerasa. Los componentes comunes son:
- Tris-HCl pH 8.5 – Mantiene el pH neutro a temperaturas de extensión.
- KCl o (NH4)2SO4 – Cationes monovalentes para la conductividad.
- MgCl2 – Cofactor de catión divalente esencial para la polimerasa.
- potenciadores de la PCR – Betaína, DMSO, estabilizadores como BSA
3. Añadir desoxinucleótidos equilibrados (dNTP)
Utilice una mezcla equimolar de dATP, DCTP, dGTP, dTTP. La concentración estándar es 100-200 µM cada uno dNTP.
4. Incluye cofactores esenciales.
Cloruro de magnesio (MgCl2) Es un cofactor crucial para la actividad y especificidad de la polimerasa.. incluir en 1-5 concentración final mM.
5. Agregar estabilizadores
Detergentes no iónicos, TDT, trehalosa, etc.. Ayuda a mantener la actividad de la polimerasa durante el almacenamiento..
6. Ajustar las concentraciones de los componentes.
Por conveniencia, haga una mezcla maestra concentrada 2X o 4X duplicando o cuadruplicando las cantidades de componentes.
7. Mezcle bien los componentes antes de dividirlos en alícuotas.
Agite vigorosamente o pipetee repetidamente para asegurar una mezcla maestra homogénea..
8. Haga alícuotas de un solo uso para su almacenamiento
Evite los ciclos de congelación y descongelación.. Para mejores resultados, almacene alícuotas congeladas y descongélelas en hielo antes de usarlas.
Al desarrollar por primera vez su mezcla maestra, siga las recetas de tampón y las concentraciones de componentes sugeridas por el fabricante de la polimerasa como punto de partida.
Optimice las concentraciones mediante pruebas iterativas para maximizar la eficiencia., especificidad, sensibilidad, y coherencia para su protocolo de PCR particular, instrumento, y aplicación.
Cómo utilizar una mezcla maestra de PCR
Usar una mezcla maestra de PCR en sus reacciones no podría ser más fácil. Aquí hay una descripción general rápida paso a paso:
- Deshielo – Deje que la mezcla maestra refrigerada se descongele completamente en hielo..
- Vórtice – Mezcle bien agitando o pipeteando hacia arriba y hacia abajo para garantizar la homogeneidad antes de dividir en alícuotas..
- Alícuota – Dispense el volumen adecuado de mezcla maestra por reacción en tubos de PCR o pocillos de placa según el tamaño de la reacción..
- Agregar cebadores – Pipetee los cebadores hacia adelante y hacia atrás en cada tubo o pocillo de reacción..
- Agregar plantilla – Agregue la muestra de ADN u otra plantilla a cada reacción..
- Completar – Si es necesario, agregue agua adicional de grado PCR para alcanzar el volumen de reacción final deseado.
- Mezcla – Mezcle suavemente con un vórtex o una pipeta para combinar todos los componentes en cada reacción..
- Centrífugo – Gire brevemente los tubos/platos para recoger el contenido en el fondo..
- PCR – Coloque las reacciones en un termociclador y comience su ejecución de PCR.!
Cuando se utiliza una mezcla maestra, agregue siempre la plantilla de ADN al final, después de las imprimaciones, para evitar la contaminación cruzada entre reacciones.
Cómo la PCR Master Mix impulsa la amplificación del ADN?
Una mezcla maestra de PCR contiene los ingredientes esenciales para la amplificación de ADN en un formato listo para usar.. El uso de una mezcla maestra simplifica la configuración de la reacción., reduce los errores, y mejora la consistencia.
Hay diferentes tipos de mezclas maestras optimizadas disponibles para PCR estándar, qPCR, PCR de alta fidelidad, RT-PCR, y más. También puedes hacer tu propia mezcla personalizada., pero los productos comerciales ofrecen extensas pruebas de calidad y conveniencia..
Comprender la mezcla maestra de PCR ayuda a garantizar resultados exitosos para todas sus necesidades de amplificación. Con el poder de la mezcla maestra en su kit de herramientas de biología molecular, La experimentación con el ADN se vuelve fácil.
