ВВЕДЕНИЕ ПЦР SITU
В научных исследованиях, Создание каждой новой технологии приносит ряд новых результатов исследований, тем самым продвигая различные дисциплины. В области морфологических исследований, Введение электронного микроскопа в 1950 -х годах поставило подробные исследования с клеточного уровня до субклеточного уровня.
В 1960 -х и 1970 -х годах, Широкое применение иммуногистохимии и иммуноцитохимических технологий подталкивало наблюдения из субклеточных структур к белковому молекулярному уровню, Включение локализации многочисленных активных веществ в клетках или субклеточных уровнях. Это оказало глубокое влияние на развитие медицинской биологии.
В 1970 -х годах было показано широкое применение методов молекулярной биологии в морфологии, и с появлением гибридизации in situ, Специфические последовательности ДНК или РНК в тканях и клетках могут быть локализованы. Эти продвинутые наблюдения от уровня белка до уровня генов, Таким образом, углубляя человеческое понимание многих жизненных явлений на генетическом уровне.
В 1980 -х годах, мощная техника в области молекулярной биологии, ПЦР (полимеразной цепной реакции), был введен. Это было быстро принято в морфологических исследованиях, разрешение локализации и наблюдения специфической низкой копии или однопирующей ДНК или РНК внутри клеток. Появление этой технологии обещает принести больше результатов исследований, Принятие морфологических исследований значительный шаг вперед.
Фундаментальные принципы
Основной принцип технологии ПЦР in situ состоит в том, чтобы объединить высокоэффективное усиление технологии ПЦР с клеточной локализацией гибридизации in situ. Это позволяет обнаружить in situ специфических низкополированных или однопирующих последовательностей ДНК или РНК в тканевых клетках.
Технология ПЦР усиливает конкретные целевые последовательности, руководствуясь праймерами посредством циклов денатурации, отжиг, и расширение праймера под действием ДНК -полимеразы. Амплифицированные целевые последовательности (Обычно можно усилить на 10^6 раз) легко отображаются с помощью гелевого электрофореза или гибридизации южной блоттинга. Поэтому, Технология ПЦР очень чувствительна и специфична, и с автоматизацией и стабильностью термического велосипеда, становится легко работать. Однако, ПЦР выполняется в жидкой фазе, требует нарушения клеток для извлечения нуклеиновых кислот в качестве матриц перед амплификацией. Это затрудняет корреляцию ПЦР, результаты с морфологической структурой тканевых клеток и определение типа клеток, содержащего специфическую последовательность мишени.
Технология ПЦР in situ Успешно объединяет ПЦР и гибридизацию in situ, Сохранение преимуществ обоих при соблюдении компенсации их соответствующих недостатков. Образцы для ПЦР in situ обычно химически фиксируются для поддержания хороших морфологических структур тканевых клеток. Как клеточные мембраны, так и ядерные мембраны имеют определенную проницаемость, разрешение компонентов, таких как праймеры, ДНК-полимераза, и нуклеотиды для попадания клеток или ядер во время ПЦР -амплификации. Фиксированная внутриклеточная или внутриядерная РНК или ДНК служит шаблонами для амплификации in situ. Амплифицированные продукты, как правило, большие молекулы или переплетаются друг с другом, им затрудняет диффундировать через клеточную мембрану или внутри мембраны, Таким образом, сохраняется на месте. Сюда, Оригинальные внутриклеточные низкоопитки или одноописные специфические ДНК или РНК-последовательности экспоненциально амплифицируются in situ, и амплифицированные продукты могут быть легко обнаружены методами гибридизации in situ.
Основные типы
На основании того, мечены ли нуклеотиды или праймеры, используемые в реакции амплификации, Технология ПЦР на месте можно разделить на две основные категории: прямые и косвенные методы. Кроме того, есть технология ПЦР с обратной транскрипцией in situ.
Прямая технология ПЦР на месте
В прямой технологии ПЦР на месте, Амплифицированный продукт непосредственно носит маркированную молекулу, то есть, Использование меченных фрагментов аденозина трифосфата или праймера. Когда образец подвергается усилению ПЦР, меченные молекулы включены в амплифицированный продукт, отображая маркеры, таким образом, делая специфическую ДНК или РНК видимой в образце (на месте).
Общие маркеры включают радиоактивный изотоп «, биотин, и дигоксигенин. Эти маркеры’ позиции визуализируются с использованием авторадиографии, Аффинтная гистохимия, или методы иммуногистохимии.
Преимущества:
- Простая операция
- Короткий процесс
- Экономия времени
Недостатки:
- Более низкая специфичность
- Склонен к ложным положительным
- Более низкая эффективность усиления, особенно в парафиновых секциях
Эти недостатки являются заметными в парафиновых срезах из -за потенциального повреждения ДНК во время обработки (фиксация, обезвоживание, внедрение). Поврежденная ДНК может быть восстановлена с использованием меченных нуклеотидов, приводя к ложным позитивам. Использование меченных праймеров в ПЦР прямое на месте дополнительно снижает эффективность усиления.
Косвенная технология ПЦР на месте
Косвенная ПЦР -технология in situ включает амплификацию специфической ДНК или РНК в клетках, с последующей гибридизацией in situ с мечеными зондами, значительно улучшает специфичность. Этот метод в настоящее время является наиболее широко используемой технологией ПЦР на месте..
Отличия от прямого метода:
- Реакционная система такая же, как обычная ПЦР
- НЕТ метки на праймеры или аденозин -трифосфат
В косвенной ПЦР на месте ПЦР, Усиление достигается в первую очередь, с последующим обнаружением амплифицированных специфических продуктов ДНК с использованием методов гибридизации in situ. Этот метод также известен как гибридизация ПЦР in situ (ПРИГОТОВЛЕНИЕ).
Преимущества:
- Более высокая специфичность
- Более высокая эффективность усиления
Недостатки:
- Более сложные работы по сравнению с прямым методом
Технология обратной транскрипции in situ
ПЦР с обратной транскрипцией in situ (RT-PCR in situ) является новой технологией, которая применяет методы RT-PCR с жидко-фазой к образцам тканевых клеток. В отличие от ОТ-ПЦР (жидкая фаза), Перед выполнением ПЦР с обратной транскрипцией in situ, Образцы ткани обрабатывают ДНКазой для уничтожения любой ДНК, присутствующей в ткани, Обеспечение синтезированной кДНК матрицы амплификации синтезируется от мРНК, не оригинальная ДНК в клетке. Другие основные шаги похожи на RT-PCR с жидкой фазой-фазой.
Основные шаги
Основные этапы технологии ПЦР in situ включают подготовку образцов, Усиление in situ (ПЦР), и обнаружение на месте. Шаги подробно описаны ниже, с акцентом на участки парафина в качестве примера.
Подготовка образцов
Технология ПЦР in situ может применяться к суспензиям клеток, клеточные мазки, замороженные секции, и парафиновые срезы. По сравнению с другими методами, Выполнение ПЦР in situ на подвесных неповрежденных клетках дает наилучшие результаты, в то время как парафиновые срезы дают худшее. Несмотря на это, Последние достижения сообщают о удовлетворительной эффективности ПЦР в парафиновых среках.
Проблемы:
- Плохая теплопровод и неровная тепловая конвекция на слайдах
- Адсорбция ДНК -полимеразы TAQ с помощью стеклянных слайдов
- Отсутствие интактных цитоплазматических или ядерных мембран, приводящих к диффузному усилению продуктов
Фиксация:
- Фиксация формалина или параформальдегида (10% забуференный формалин или 4% Параформальдегид) Хорошо работает для ПЦР на месте
- Оптимальное время фиксации: 4-6 часы при 4°C
Толщина участка:
- Более толстые срезы дают лучшие результаты из -за более высокого содержания ДНК -мишени и большего количества мембранных структур, предотвращение диффузии продукта. Однако, Более толстые срезы могут снизить качество и разрешение морфологического наблюдения.
Слайд-обработка:
- Предотвратить отряд тканей во время ПЦР и гибридизации in situ путем обработки слайдов полизином или силанизацией.
Пищеварение протеиназы
Перед усилением in situ, Образцы ткани нуждаются в обработке протеиназы. Расщепление протеиназы увеличивает проницаемость клеток, позволяя компонентам реакции вводить ячейки и подвергать целевой последовательности для амплификации. Обычно используемые протеиназы включают протеиназу K, трипсин, или пепсин. Степень пищеварения должна быть скорректирована на основе фиксации тканей. После пищеварения, Обеспечить инактивацию фермента путем нагрева или тщательного промывания, Поскольку остаточные ферменты могут разрушать ДНК -полимеразу TAQ в реакции ПЦР.
Плюсы и минусы:
- Пищеварение увеличивает проницаемость, помогая последующим реакциям
- Это также может увеличить вероятность диффузии продукта, приводя к ложным позитивам или негативам.
Усиление in situ (ПЦР)
Амплификация in situ относится к выполнению реакции ПЦР непосредственно на образцах тканевых клеток. Его основной принцип полностью такой же, как и у жидкой фазы ПЦР.
Праймеры
Праймеры, используемые в ПЦР 15-30 пар оснований (б.п.) по длине, и усиленные фрагменты о 100-1000 б.п.. Кортерные праймеры предпочтительнее для ПЦР in situ. ДНК, извлеченная из парафиновых срезов, редко заканчивается 400 б.п., и РНК редко заканчивается 200 б.п.. Более длинные последовательности более подвержены несоответствиям между праймерами и шаблонами, приводя к неспецифическим реакциям.
Система реакции
Система реакции для ПЦР in situ в основном похожа на обычную жидкость ПЦР. Однако, Поскольку он проводится на срезах с фиксированными тканями, Для достижения лучших результатов усиления, предполагается, что концентрации праймеров, ДНК-полимераза Taq, и Mg²⁺ в реакционной системе должны быть выше, чем в ПЦР жидкости. Бычий сывороточный альбумин (BSA) Должен быть добавлен в систему реакции, чтобы предотвратить связывание ДНК -полимеразы TAQ с стеклянным слайдом, что может снизить эффективность усиления.
Термальный велоспорт
Тепловая велосипедная велосипеда для ПЦР in situ может быть выполнена на специализированном термическом циклере, который прост в эксплуатации. Он также может быть сделан на общем термоциклере ПЦР, покрыв платформу образцов слоем алюминиевой фольги, чтобы создать платформу, Заполнение места на платформе образцов минеральным маслом или водой, и размещение слайдов на платформу для выполнения этапов термического велосипеда.
Для обеспечения достаточного усиления, Продолжительность каждого шага в процессе термического цикла для ПЦР in situ может быть немного длиннее, чем для обычной ПЦР. Кроме того, Метод горячего старта может быть использован, где слайд нагревается до 80-94 ° C, прежде чем немедленно добавление ДНК-полимеразы TAQ.
Чтобы минимизировать потерю реакционной системы во время процесса термического цикла, чистый лак для ногтей, минеральное масло, или ручка PAP может использоваться для герметизации края крышки.
Мойка
После усиления in situ, Образец следует промыть для удаления амплифицированных продуктов, которые диффундировали вне ячеек. Недостаточная промывка может привести к видимым амплифицированным продуктам во время обнаружения, вызывая высокие фоновые или ложноположительные результаты. Однако, Чрезмерная промывка может также элюировать амплифицированные продукты внутри клеток, ослабление или потеря положительного сигнала.
Некоторые авторы рекомендуют после фиксации с 4% параформальдегид для 2 часов или 2% глутаровый альдегид для 5 Через минуты после усиления для сохранения амплифицированных продуктов внутри ячеек во время обнаружения, повышение чувствительности и специфичности.
Обнаружение in situ
Метод обнаружения продуктов амплификации ПЦР на месте зависит от дизайна ПЦР in situ. Прямое метод включает в себя прямое обнаружение in situ на основе природы меченых молекул. Косвенное метод требует гибридизации in situ для обнаружения.
Обнаружение, помеченное флуоресцеином, биотин, щелочная фосфатаза, или пероксидаза хрена следует те же принципы, что и методы иммуногистохимии и гистохимии аффинности.
Применение технологии ПЦР на месте
Значительным преимуществом технологии ПЦР in situ является ее способность обнаруживать специфические последовательности генов с низкими количествами копий непосредственно в тканевых клетках. В зависимости от характера тестируемого гена, Применение ПЦР in situ можно разделить на обнаружение экзогенных и эндогенных генов.
1. Обнаружение экзогенных генов
(1) Обнаружение вирусного гена
Инфицированные клетки вирусами часто не имеют эффективных методов обнаружения. Однако, С применением технологии ПЦР на месте, Эта сложная проблема имеет многообещающее решение. Обнаружение различных вирусов, таких как ВИЧ, HPV, HSV, HBV, и HCV позволяет нам наблюдать за этими вирусами’ Роли в СПИДе, Опухоли репродуктивной системы, гепатит, и рак печени и незамедлительно идентифицировать инфицированные популяции.
(2) Обнаружение бактериального гена
Наиболее выдающимся применением является обнаружение микобактерии туберкулеза. Когда поражения туберкулеза нетипичны, Трудно найти Mycobacterium Tuberculosis под микроскопом, используя специальные методы окрашивания. Технология ПЦР in situ может помочь в достижении окончательного диагноза, Даже когда Mycobacterium tuberculosis мало.
(3) Обнаружение введенных генов
В исследованиях трансгенных животных, подтверждение того, был ли введен ген, и у пациентов, получающих генную терапию, Проверка, присутствует ли введенный ген, Можно ли быть достигнуто с помощью технологии ПЦР на месте. Таким образом, ПЦР in situ стала важным методом обнаружения.
2. Обнаружение эндогенных генов
(1) Обнаружение аномальных генов
Технология ПЦР in situ может обнаружить мутации генов и перестройки в организме, такие как мутации генов гена протоонкогена и супрессора опухоли, и перегруппировки генов тяжелой цепи иммуноглобулина при злокачественных лимфомах. Это предлагает широкие перспективы применения для исследования и диагностики опухоли.
(2) Обнаружение внутренних генов
Для низко экспрессированных внутренних генов в клетках тела только с одним или несколькими копиями, Технология гибридизации in situ неэффективна из -за низкого количества копий генов. В то время как жидкость ПЦР может амплифицировать и обнаруживать эти гены, он не может определить тип ячейки, содержащий ген. Технология ПЦР in situ преодолевает ограничения этих двух методов, позволяя нам обнаружить различные человеческие гены и завершить карту генов человека.
Гибридизация флуоресценции in situ (РЫБА)
Флуоресцентная гибридизация in situ - это метод физического картирования, в котором используются флуоресцентно меченные зонды для обнаружения гибридизации между зондами и хромосомами при метафазе или хроматине в интерфазе.
Разработан в конце 1980 -х годов, Рыба развивалась из радиоактивной технологии гибридизации in situ до нерадиоактивного молекулярного цитогенетического метода путем замены изотопного маркировки флуоресцентной маркировкой. В рыбе, зонд сначала в сочетании с репортерной молекулой, который затем связан с флуоресцентным красителем посредством иммуноцитохимического процесса после гибридизации.
Основной принцип рыбы - маркировать ДНК (или РНК) зонды со специальными нуклеотидными молекулами, гибридизовать эти зонды непосредственно в хромосомы или срезы ДНК -волокна, и использовать моноклональные антитела в сочетании с флуоресцентными молекулами, чтобы специфически связываться с молекулами зонда. Это допускает качественный, позиционирование, и относительный количественный анализ последовательностей ДНК на хромосомах или срезах ДНК -волокна.
Рыба обеспечивает безопасность, скорость, высокая чувствительность, Долгосрочное сохранение зонда, и возможность одновременно отображать несколько цветов. Он может отображать как метафазные хромосомы, так и межфазные ядра. Более того, Многоцветная флуоресцентная гибридизация in situ и флуоресцентная флуоресценция хроматина. Методы гибридизации in situ были разработаны на основе рыбы.
Для рРНК Гибридизация флуоресценции in situ, Несколько факторов могут привести к низкой интенсивности сигнала флуоресценции:
- Низкое содержание клеточной рибосомы
- Низкая клеточная проницаемость мембраны
- Низкая доступность последовательности с низкой мишенью из -за складывания рРНК, где некоторые позиции тесно связаны с другими цепями или белками, предотвращение гибридизации зонда с целевой последовательности.
Чтобы проверить, легко ли целевая последовательность в клетках гибридизируется с помощью зонда и определить оптимальную температуру гибридизации, «клон-рыба» можно использовать: Гены рРНК включены в плазмиды, выражен в e. coli для формирования рибосомов, а затем гибридизован с флуоресцентно меченными зондами.
Рыба также может быть объединена с проточной цитометрией, чтобы подсчитать или изолировать специально флуоресцентно меченные клетки.
