原位PCR簡介
在科學研究方面, 每一項新技術的建立都會帶來一系列新的研究成果, 從而推動各個學科的發展. 在形態學研究領域, 20 世紀 50 年代電子顯微鏡的引入將詳細研究從細胞層面延伸至亞細胞水平.
在 20 世紀 60 年代和 1970 年代, 免疫組織化學和免疫細胞化學技術的廣泛應用將觀察從亞細胞結構推向了蛋白質分子水平, 使許多活性物質能夠在細胞內或亞細胞層級定位. 這對醫學生物學的發展產生了深遠的影響.
1970年代分子生物學技術在形態學領域已廣泛應用, 隨著原位雜交的出現, 可以定位組織和細胞內的特定 DNA 或 RNA 序列. 這種從蛋白質水平到基因水平的先進觀察, 從而在基因層面加深人類對許多生命現象的理解.
1980年代, 分子生物學領域的一項強大技術, 聚合酶鍊式反應 (聚合酶鍊式反應), 被介紹. 它很快就被形態學研究所採用, 允許定位和觀察細胞內特定的低拷貝或單拷貝 DNA 或 RNA. 這項技術的出現有望帶來更多的研究成果, 形態學研究向前邁出了重要一步.
基本原則
原位PCR技術的基本原理是將PCR技術的高效擴增與原位雜交的細胞定位結合. 這允許原位檢測組織細胞內特定的低拷貝或單拷貝 DNA 或 RNA 序列.
PCR 技術透過變性循環在引子引導下擴增特定標靶序列, 退火, 以及在DNA聚合酶作用下的引子延伸. 擴增的標靶序列 (通常可以放大10^6倍) 透過凝膠電泳或 Southern blot 雜交可輕鬆顯示. 所以, PCR技術具有高度敏感性和特異性, 並具有熱循環的自動化和穩定性, 操作變得容易. 然而, PCR 在液相中進行, 擴增前需要破碎細胞以萃取核酸作為模板. 這使得很難將 PCR 結果與組織細胞的形態結構相關聯並確定包含特定目標序列的細胞類型.
原位PCR技術成功地將PCR和原位雜交結合起來, 保留兩者的優點，同時彌補各自的缺點. 原位PCR的樣本通常經過化學固定，以保持組織細胞良好的形態結構. 細胞膜和核膜都具有一定的通透性, 允許底漆等成分, DNA聚合酶, PCR 擴增過程中進入細胞或細胞核的核苷酸. 固定的細胞內或核內 RNA 或 DNA 作為原位擴增的模板. 擴增產物一般為大分子或相互纏繞, 使它們難以透過細胞膜或膜內擴散, 從而被保留在原地. 這邊走, 原始細胞內低拷貝或單拷貝特定DNA或RNA序列原位指數擴增, 擴增產物可以透過原位雜交技術輕鬆檢測.
基本類型
基於擴增反應中使用的核苷酸或引子是否被標記, 原位PCR技術可分為兩大類: 直接法和間接法. 另外, 有原位逆轉錄PCR技術.
直接原位PCR技術
直接原位PCR技術, 擴增產物直接攜帶標記分子, IE。, 使用標記的三磷酸腺苷或引子片段. 當樣本進行PCR擴增時, 標記分子被整合到擴增產物中, 顯示標記, 從而使樣本中的特定 DNA 或 RNA 可見 (現場).
常見標記物包括放射性同位素 ³⁵S, 生物素, 和地高辛. 這些標記’ 使用放射自顯影術使位置可視化, 親和組織化學, 或免疫組織化學方法.
優點:
- 操作簡單
- 流程短
- 省時
缺點:
- 特異性較低
- 容易出現誤報
- 擴增效率較低, 尤其是在石蠟切片中
由於處理過程中潛在的 DNA 損傷，這些缺點在石蠟切片中特別突出 (固定, 脫水, 嵌入). 使用標記的核苷酸可以修復受損的 DNA, 導致誤報. 在直接原位 PCR 中使用標記引子進一步降低了擴增效率.
間接原位PCR技術
間接原位 PCR 技術涉及細胞內特定 DNA 或 RNA 的擴增, 然後用標記探針進行原位雜交, 顯著提高特異性. 此方法是目前應用最廣泛的原位PCR技術.
與直接法的區別:
- 反應體系與常規PCR相同
- 引子或三磷酸腺苷上未使用任何標記
間接原位PCR, 首先實現放大, 然後使用原位雜交技術檢測擴增的特定 DNA 產物. 此方法也稱為PCR原位雜交 (烹飪).
優點:
- 更高的特異性
- 更高的擴增效率
缺點:
- 與直接法相比操作步驟更複雜
原位逆轉錄PCR技術
原位逆轉錄PCR (原位RT-PCR) 是將液相RT-PCR技術應用於組織細胞檢體的新技術. 與 RT-PCR 不同 (液相), 在進行原位逆轉錄 PCR 之前, 組織樣本經過 DNase 處理，以破壞組織中存在的任何 DNA, 確保擴增模板是從 mRNA 合成的 cDNA, 不是細胞中的原始DNA. 其他基本步驟與液相RT-PCR類似.
基本步驟
原位PCR技術的基本步驟包括標本製備, 原位放大 (聚合酶鍊式反應), 和原位檢測. 詳細步驟如下, 以石蠟切片為例.
標本製備
原位PCR技術可應用於細胞懸浮液, 細胞塗片, 冰凍切片, 和石蠟切片. 與其他方法相比, 對懸浮的完整細胞進行原位 PCR 可獲得最佳結果, 而石蠟切片的效果最差. 儘管如此, 最近的進展顯示石蠟切片的 PCR 效率令人滿意.
挑戰:
- 載玻片導熱不良、熱對流不均勻
- 玻片吸附 Taq DNA 聚合酶
- 缺乏完整的細胞質或核膜導致擴增產物擴散
固定:
- 福馬林或多聚甲醛固定 (10% 緩衝福馬林或 4% 多聚甲醛) 非常適合原位 PCR
- 最佳固定時間: 4-6 4°C 小時
斷面厚度:
- 由於目標 DNA 含量較高且膜結構較多，較厚的切片可產生較好的結果, 防止產品擴散. 然而, 較厚的切片會降低形態觀察質量和分辨率.
載玻片處理:
- 透過聚-L-賴氨酸或矽烷化處理玻片來防止 PCR 和原位雜交過程中的組織脫離.
蛋白酶消化
原位擴增前, 組織標本需要蛋白酶處理. 蛋白酶消化增加細胞通透性, 允許反應成分進入細胞並暴露目標序列以進行擴增. 常用的蛋白酶包括蛋白酶K, 胰蛋白酶, 或胃蛋白酶. 消化程度應依組織固定狀況進行調整. 消化後, 透過加熱或徹底清洗確保酵素失活, 因為殘留酵素會破壞 PCR 反應中的 Taq DNA 聚合酶.
優點和缺點:
- 消化增加滲透性, 幫助後續反應
- 它還可以增加產品擴散的機會, 導致誤報或漏報.
原位放大 (聚合酶鍊式反應)
原位擴增是指直接對組織細胞檢體進行PCR反應. 其基本原理與液相PCR完全相同.
引子
PCR 中使用的引子通常是 15-30 鹼基對 (BP) 長度, 擴增片段約為 100-1000 BP. 原位 PCR 優選較短的引物. 從石蠟切片中提取的 DNA 很少會結束 400 BP, RNA很少結束 200 BP. 較長的序列更容易出現引子和模板之間的錯配, 導致非特異性反應.
反應系統
原位PCR的反應體系與常規液相PCR基本相似. 然而, 因為它是在固定的組織切片上進行的, 以達到更好的放大效果, 建議引子濃度, Taq DNA聚合酶, 反應體系中的Mg2⁺含量應高於液相PCR中的含量. 牛血清白蛋白 (牛血清白蛋白) 應添加到反應系統中以防止 Taq DNA 聚合酶與玻片結合, 這可能會降低擴增效率.
熱循環
原位 PCR 的熱循環可以在專用熱循環儀上進行, 操作簡單. 也可以在通用 PCR 熱循環儀上完成，用一層鋁箔紙覆蓋樣品平台以形成平台, 用礦物油或水填滿樣品平台上的空間, 並將載玻片放置在平台上以執行熱循環步驟.
確保足夠的放大, 原位PCR熱循環過程中每個步驟的持續時間可以比常規PCR稍長. 另外, 可採用熱啟動方式, 將玻片加熱至 80-94°C，然後立即加入 Taq DNA 聚合酶.
盡量減少熱循環過程中反應體系的損失, 透明指甲油, 礦物油, 或可使用 PAP 筆密封蓋玻片的邊緣.
洗滌
原位放大後, 應清洗標本以去除擴散到細胞外的擴增產物. 洗滌不充分可能會導致檢測過程中出現可見的擴增產物, 導致高背景或假陽性結果. 然而, 過度洗滌也可能洗脫細胞內的擴增產物, 減弱或失去正面訊號.
一些作者建議使用後固定 4% 多聚甲醛用於 2 小時或 2% 戊二醛用於 5 擴增後幾分鐘，以便在檢測期間將擴增產物保留在細胞內, 提高敏感性和特異性.
原位偵測
原位PCR擴增產物的檢測方法取決於原位PCR設計. 直接法涉及根據標記分子的性質進行直接原位檢測. 間接方法需要原位雜交進行檢測.
螢光素標記檢測, 生物素, 鹼性磷酸酶, 或辣根過氧化物酶遵循與免疫組織化學和親和組織化學技術相同的原理.
原位PCR技術的應用
原位PCR技術的顯著優勢是能夠直接在組織細胞內檢測低拷貝數的特定基因序列. 取決於所測試基因的性質, 原位PCR的應用可分為外源基因檢測與內源性基因檢測.
1. 外源基因檢測
(1) 病毒基因檢測
被病毒感染的細胞往往缺乏有效的檢測方法. 然而, 原位PCR技術的應用, 這個具有挑戰性的問題有一個有希望的解決方案. 檢測各種病毒，例如HIV, HPV病毒, 單純皰疹病毒, B型肝炎病毒, HCV 使我們能夠觀察這些病毒’ 在愛滋病中的作用, 生殖系統腫瘤, 肝炎, 和肝癌並及時辨識感染人群.
(2) 細菌基因檢測
最突出的應用是結核分枝桿菌的檢測. 當結核病灶不典型時, 使用特殊染色方法在顯微鏡下很難找到結核分枝桿菌. 原位 PCR 技術可協助做出明確診斷, 即使結核分枝桿菌稀缺.
(3) 導入基因的檢測
在基因改造動物研究中, 確認是否已導入基因, 以及接受基因治療的患者, 驗證導入基因是否存在, 兩者都可以使用原位 PCR 技術來完成. 因此, 原位PCR已成為重要的檢測方法.
2. 內源基因檢測
(1) 異常基因檢測
原位PCR技術可以檢測體內基因突變和重排, 如原癌基因和抑癌基因突變, 和惡性淋巴瘤中的免疫球蛋白重鏈基因重排. 這為腫瘤研究和診斷提供了廣泛的應用前景.
(2) 內在基因的檢測
對於體細胞內只有一個或幾個拷貝的低表達內在基因, 原位雜交技術因基因拷貝數低而無效. 而液相PCR可以擴增並檢測這些基因, 它無法確定包含該基因的細胞類型. 原位PCR技術克服了這兩種技術的局限性, 使我們能夠檢測各種人類基因並完成人類基因圖譜.
螢光原位雜交 (魚)
螢光原位雜交是利用螢光標記探針檢測探針與中期染色體或間期染色質雜交的物理作圖方法.
1980年代末期開發, FISH從放射性原位雜交技術發展為以螢光標記取代同位素標記的非放射性分子細胞遺傳學技術. 在魚中, 探針首先與報告分子結合, 然後透過雜交後的免疫細胞化學過程與螢光染料連接.
FISH的基本原理是標記DNA (或RNA) 具有特殊核苷酸分子的探針, 將這些探針直接與染色體或 DNA 纖維片段雜交, 並使用與螢光分子偶聯的單株抗體特異性結合探針分子. 這允許定性, 位置性的, 染色體或DNA纖維切片上DNA序列的相對定量分析.
FISH 提供安全性, 速度, 高靈敏度, 探針長期保存, 以及同時顯示多種顏色的能力. 它可以顯示中期染色體和間期細胞核. 另外, 基於FISH技術，發展了多色螢光原位雜交和染色質纖維螢光原位雜交技術.
為了 核糖核酸 螢光原位雜交, 有幾個因素可能導致螢光訊號強度低:
- 細胞核醣體含量低
- 細胞膜通透性低
- rRNA 折疊導致目標序列可及性低, 其中某些位置與其他鍊或蛋白質緊密結合, 防止探針與目標序列雜交.
測試細胞內的標靶序列是否容易被探針雜交並確定最佳雜交溫度, “克隆FISH” 可以使用: rRNA基因被整合到質粒中, 以E表示. 大腸桿菌形成核醣體, 然後與螢光標記探針雜交.
FISH 也可以與流式細胞儀結合來計數或分離特異性螢光標記的細胞.
