현장 PCR 소개
과학 연구에서, 각 새로운 기술의 설립은 일련의 새로운 연구 결과를 제공합니다., 따라서 다양한 분야를 발전시킵니다. 형태 학적 연구 분야에서, 1950 년대 전자 현미경의 도입은 세포 수준에서 세포 수준으로 상세한 연구를 가져 왔습니다..
1960 년대와 1970 년대, 면역 조직 화학 및 면역 세포 화학 기술의 광범위한 적용은 세포 내 구조에서 단백질 분자 수준으로 관찰을 밀어 냈다., 세포 또는 세포 내 수준 내에서 수많은 활성 물질의 국소화 가능. 이것은 의료 생물학의 개발에 큰 영향을 미쳤습니다..
1970 년대는 형태에서 분자 생물학 기술의 광범위한 적용을 보았습니다., 그리고 현장 혼성화의 출현으로, 조직 내의 특정 DNA 또는 RNA 서열과 세포가 국소화 될 수있다.. 단백질 수준에서 유전자 수준까지 의이 진행된 관찰, 따라서 유전자 수준에서 많은 생명 현상에 대한 인간의 이해를 심화시킵니다..
1980 년대, 분자 생물학 분야의 강력한 기술, PCR (폴리 메라 제 연쇠 반응), 소개되었습니다. 그것은 형태 학적 연구에서 빠르게 채택되었습니다, 세포 내에서 특정 저소산 또는 단일-코피 DNA 또는 RNA의 국소화 및 관찰 허용. 이 기술의 출현은 더 많은 연구 결과를 가져올 것을 약속합니다, 형태 학적 연구를 중대한 진전으로 취합니다.
기본 원칙
현장 PCR 기술의 기본 원리는 PCR 기술의 고효율 증폭을 현장 하이브리드 화의 세포 위치와 결합하는 것입니다.. 이것은 조직 세포 내에서 특정 저소체 또는 단일 -Copy DNA 또는 RNA 서열의 인시 튜 검출을 허용합니다..
PCR 기술은 변성 사이클을 통해 프라이머에 의해 안내되는 특정 목표 시퀀스를 증폭시킵니다., 가열 냉각, 및 DNA 폴리머 라제의 작용 하의 프라이머 연장. 증폭 된 표적 서열 (일반적으로 10^6 회 증폭 될 수 있습니다) 겔 전기 영동 또는 남부 블롯 혼성화를 통해 쉽게 표시됩니다.. 그러므로, PCR 기술은 매우 민감하고 구체적입니다, 열 순환의 자동화 및 안정성으로, 작동하기 쉬워집니다. 하지만, PCR은 액체상에서 수행된다, 증폭 전에 템플릿으로 핵산을 추출하기 위해 세포 파괴가 필요합니다.. 이것은 PCR 결과를 조직 세포의 형태 학적 구조와 상관시키고 특정 표적 서열을 포함하는 세포 유형을 결정하기가 어렵다..
현장 PCR 기술은 PCR과 현장 혼성화를 성공적으로 결합합니다., 각각의 단점을 보상하면서 두 가지 장점을 유지. 현장 PCR에 대한 샘플은 일반적으로 화학적으로 고정되어 조직 세포의 좋은 형태 학적 구조를 유지합니다.. 세포막과 핵막 모두 특정 투과성을 갖는다, 프라이머와 같은 구성 요소를 허용합니다, DNA 중합효소, 및 PCR 증폭 동안 세포 또는 핵으로 들어가는 뉴클레오티드. 고정 된 세포 내 또는 핵내 RNA 또는 DNA는 현장 증폭을위한 템플릿 역할을합니다.. 증폭 된 제품은 일반적으로 큰 분자이거나 서로 얽혀 있습니다., 세포막을 통해 또는 막 내에서 확산하기가 어렵습니다., 따라서 현장에서 유지됩니다. 이런 식으로, 원래의 세포 내 저소도 또는 단일 -Copy 특이 적 DNA 또는 RNA 서열은 현장에서 지수 적으로 증폭된다., 그리고 증폭 된 제품은 현장 하이브리드 화 기술에 의해 쉽게 감지 될 수 있습니다..
기본 유형
증폭 반응에 사용 된 뉴클레오티드 또는 프라이머가 표지되어 있는지 여부에 기초합니다., 현장 PCR 기술은 두 가지 주요 범주로 나눌 수 있습니다.: 직간접적인 방법. 추가적으로, 현장 역전사 PCR 기술이 있습니다.
직접 현장 PCR 기술
직접 현장 PCR 기술, 증폭 된 생성물은 라벨링 된 분자를 직접 전달합니다, 즉., 표지 된 아데노신 트리 포스페이트 또는 프라이머 단편을 사용합니다. 시편이 PCR 증폭을 겪을 때, 표지 된 분자는 증폭 된 생성물에 통합된다, 마커 표시, 따라서 시편에서 특정 DNA 또는 RNA가 보이게합니다. (현장).
일반적인 마커에는 방사성 동위 원소 ³⁵s가 포함됩니다, 비오틴, 및 디 록시 게닌. 이 마커’ 위치는 자동 방사선 촬영을 사용하여 시각화됩니다, 친화력 조직 화학, 또는 면역 조직 화학 방법.
장점:
- 간단한 작동
- 짧은 과정
- 시간 절약
단점:
- 더 낮은 특이성
- 잘못된 긍정적 인 긍정
- 증폭 효율이 낮습니다, 특히 파라핀 섹션에서
이러한 단점은 처리 중 잠재적 인 DNA 손상으로 인해 파라핀 섹션에서 두드러집니다. (정착, 탈수, 임베딩). 손상된 DNA는 표지 된 뉴클레오티드를 사용하여 복구 할 수 있습니다, 잘못된 긍정으로 이어집니다. 직접 현장 PCR에서 라벨링 된 프라이머를 사용하여 증폭 효율을 더욱 감소시킵니다..
간접적 인 현장 PCR 기술
간접적 인 현장 PCR 기술은 세포 내에서 특정 DNA 또는 RNA의 증폭을 포함합니다., 라벨이 붙은 프로브로 현장 하이브리드 화, 특이성을 크게 향상시킵니다. 이 방법은 현재 가장 널리 사용되는 현장 PCR 기술입니다..
직접 방법과의 차이:
- 반응 시스템은 기존 PCR과 동일합니다
- 프라이머 또는 아데노신 트리 포스페이트의 라벨이 사용되지 않았습니다
간접적 인 현장 PCR, 증폭이 먼저 달성됩니다, 현장 하이브리드 화 기술을 사용하여 증폭 된 특정 DNA 생성물의 검출. 이 방법은 PCR 인시 튜 하이브리드 화라고도합니다. (타자).
장점:
- 더 높은 특이성
- 더 높은 증폭 효율
단점:
- 직접 방법과 비교하여 더 복잡한 작동 단계
현장 역전사 PCR 기술
현장 역전사 PCR (현장 RT-PCR) 액체상 RT-PCR 기술을 조직 세포 표본에 적용하는 새로운 기술입니다.. RT-PCR과 달리 (액체상), 현장 역전사 PCR을 수행하기 전에, 조직 표본은 조직에 존재하는 DNA를 파괴하기 위해 DNase로 처리됩니다., 증폭 템플릿 보장은 mRNA로부터 cDNA를 합성합니다., 세포의 원래 DNA가 아닙니다. 다른 기본 단계는 액체상 RT-PCR과 유사합니다.
기본 단계
현장 PCR 기술의 기본 단계에는 표본 준비가 포함됩니다., 현장 증폭 (PCR), 그리고 현장 탐지. 단계는 아래에 자세히 설명되어 있습니다, 예를 들어 파라핀 섹션에 중점을 둡니다.
시편 준비
현장 PCR 기술은 세포 현탁액에 적용될 수 있습니다., 세포 얼룩, 냉동 섹션, 및 파라핀 섹션. 다른 방법에 비해, 현탁 된 온전한 세포에서 현장 PCR을 수행하면 최상의 결과가 나옵니다., 파라핀 섹션은 최악의 결과를 산출합니다. 그럼에도 불구하고, 최근의 발전은 파라핀 섹션에서 만족스러운 PCR 효율을보고했습니다..
도전:
- 슬라이드의 열전 전도가 열악하고 불균일 한 열 대류
- 유리 슬라이드에 의한 Taq DNA 폴리머 라제의 흡착
- 확산 증폭 생성물을 유발하는 온전한 세포질 또는 핵막의 부족
정착:
- 포르말린 또는 파라 포름 알데히드 고정 (10% 완충 포르말린 또는 4% 파라 포름 알데히드) 현장 PCR에 잘 작동합니다
- 최적의 고정 시간: 4-6 4 ° C에서 시간
섹션 두께:
- 두꺼운 부분은 더 높은 표적 DNA 함량과 더 많은 막 구조로 인해 더 나은 결과를 산출합니다., 제품 확산 방지. 하지만, 두꺼운 부분은 형태 학적 관찰 품질과 해상도를 줄일 수 있습니다.
슬라이드 처리:
- 폴리 -L- 리신 또는 실란 화으로 슬라이드를 처리함으로써 PCR 및 현장 하이브리드 화 중 조직 분리를 방지합니다..
단백질 분해 효소 소화
현장 증폭 전, 조직 표본은 단백질 제 치료가 필요합니다. 단백질 분해 효소 소화는 세포 투과성을 증가시킨다, 반응 구성 요소가 세포로 들어가고 증폭을 위해 표적 서열을 노출 허용. 일반적으로 사용되는 단백질 제는 단백질 제 K를 포함한다, 트립신, 또는 펩신. 조직 고정에 따라 소화 정도를 조정해야합니다.. 소화 후, 가열 또는 철저한 세척으로 효소 불 활성화를 보장하십시오, 잔류 효소가 PCR 반응에서 TAQ DNA 폴리머 라제를 파괴 할 수 있으므로.
장단점:
- 소화는 투과성을 증가시킵니다, 후속 반응을 지원합니다
- 또한 제품 확산 가능성을 높일 수 있습니다, 거짓 긍정 또는 부정으로 이어집니다.
현장 증폭 (PCR)
현장 증폭은 조직 세포 표본에서 직접 PCR 반응을 수행하는 것을 말합니다.. 기본 원리는 액체 상 PCR과 완전히 동일합니다..
프라이머
PCR에 사용 된 프라이머는 일반적으로입니다 15-30 기본 쌍 (bp) 길이, 그리고 증폭 된 단편은 약다 100-1000 bp. 더 짧은 프라이머는 현장 PCR에 바람직하다. 파라핀 섹션에서 추출한 DNA는 거의 끝나지 않습니다 400 bp, 그리고 RNA는 거의 없습니다 200 bp. 더 긴 시퀀스는 프라이머와 템플릿 사이의 불일치가 더 발생합니다., 비특이적 반응으로 이어집니다.
반응 시스템
현장 PCR에 대한 반응 시스템은 기본적으로 기존의 액체 상 PCR과 유사합니다.. 하지만, 고정 된 조직 섹션에서 수행되므로, 더 나은 증폭 결과를 달성합니다, 프라이머의 농도는 제안된다, TAQ DNA 중합 효소, 반응 시스템에서 mg² the는 액체 상 PCR보다 높아야합니다.. 소 혈청 알부민 (BSA) 유리 슬라이드에 TAQ DNA 폴리머 라제의 결합을 방지하기 위해 반응 시스템에 추가해야합니다., 증폭 효율을 줄일 수 있습니다.
열 순환
현장 PCR에 대한 열 사이클링은 특수 열 사이클러에서 수행 될 수 있습니다., 작동하기가 간단합니다. 또한 샘플 플랫폼을 알루미늄 호일 레이어로 덮어 플랫폼을 만들어 일반 PCR 열 사이클러에서 수행 할 수 있습니다., 미네랄 오일 또는 물로 샘플 플랫폼의 공간을 채우는, 열 순환 단계를 수행하기 위해 플랫폼에 슬라이드를 배치.
충분한 증폭을 보장합니다, 현장 PCR에 대한 열 사이클링 공정의 각 단계의 지속 시간은 기존 PCR의 것보다 약간 길 수 있습니다.. 추가적으로, 핫 스타트 방법을 사용할 수 있습니다, 슬라이드가 80-94 ° C로 가열되는 경우 즉시 Taq DNA 폴리머 라제를 첨가하십시오..
열 사이클링 공정 중 반응 시스템의 손실을 최소화하려면, 명확한 매니큐어, 미네랄 오일, 또는 PAP 펜을 사용하여 덮개 슬립의 가장자리를 밀봉 할 수 있습니다..
세탁
현장 증폭 후, 셀 외부에서 확산 된 증폭 된 생성물을 제거하기 위해 시편을 세척해야합니다.. 부족한 세척은 감지 중에 가시 증폭 된 제품을 초래할 수 있습니다., 높은 배경 또는 허위 양성 결과를 유발합니다. 하지만, 과도한 세척은 또한 세포 내부의 증폭 된 생성물을 용출 할 수 있습니다., 양성 신호 약화 또는 손실.
일부 저자는 고정 후 추천합니다 4% 파라 포름 알데히드 2 시간 또는 2% 글루 타르 알데히드 5 검출 동안 세포 내에서 증폭 된 생성물을 유지하기위한 증폭 분, 감도와 특이성 향상.
현장 탐지
현장 PCR 증폭 생성물을 검출하는 방법은 현장 PCR 설계에 따라 다릅니다.. 직접 방법은 표지 된 분자의 특성에 기초하여 직접 현장 검출을 포함합니다.. 간접적 인 방법은 탐지를 위해 현장 혼성화가 필요합니다.
플루오 레세 인으로 표지 된 검출, 비오틴, 알칼리성 포스파타제, 또는 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제는 면역 조직 화학 및 친화력 조직 화학 기술과 동일한 원리를 따릅니다..
현장 PCR 기술의 응용
현장 PCR 기술의 중요한 장점은 조직 세포 내에서 직접 카피 수가 낮은 특정 유전자 서열을 검출하는 능력입니다.. 시험중인 유전자의 특성에 따라, 현장 PCR의 적용은 외인성 및 내인성 유전자의 검출로 나눌 수 있습니다..
1. 외인성 유전자의 검출
(1) 바이러스 성 유전자 검출
바이러스가있는 감염된 세포는 종종 효과적인 검출 방법이 부족합니다. 하지만, 현장 PCR 기술의 적용으로, 이 도전적인 문제에는 유망한 해결책이 있습니다. HIV와 같은 다양한 바이러스 검출, HPV, HSV, HBV, HCV를 통해 이러한 바이러스를 관찰 할 수 있습니다’ 에이즈의 역할, 생식계 종양, 간염, 간암 및 감염된 인구를 신속하게 식별합니다.
(2) 박테리아 유전자 검출
가장 두드러진 적용은 Mycobacterium tuberculosis의 검출입니다.. 결핵 병변이 비정형 일 때, 특수 염색 방법을 사용하여 현미경에서 mycobacterium tuberculosis를 찾기가 어렵습니다.. 현장 PCR 기술은 결정적인 진단을 도울 수 있습니다., Mycobacterium tuberculosis가 부족한 경우에도.
(3) 도입 된 유전자의 검출
형질 전환 동물 연구에서, 유전자가 도입되었는지 확인, 유전자 요법을받는 환자에서, 도입 된 유전자가 존재하는지 확인, 현장 PCR 기술을 사용하여 달성 할 수 있습니다. 따라서, 현장 PCR은 중요한 탐지 방법이되었습니다.
2. 내인성 유전자의 검출
(1) 비정상 유전자의 검출
현장 PCR 기술은 신체 내 유전자 돌연변이 및 재 배열을 감지 할 수 있습니다., 프로토-온 코겐 및 종양 억제제 유전자 돌연변이와 같은, 및 악성 림프종에서 면역 글로불린 중쇄 유전자 재 배열. 이것은 종양 연구 및 진단에 대한 광범위한 응용 전망을 제공합니다..
(2) 고유 유전자의 검출
단 하나 또는 몇 개의 사본만으로 신체 세포 내의 저 발현 고유 유전자의 경우, 현장 하이브리드 화 기술은 낮은 유전자 카피 수로 인해 효과가 없습니다.. 액체 상 PCR은 이들 유전자를 증폭시키고 감지 할 수있다, 유전자를 포함하는 세포 유형을 결정할 수 없습니다. 현장 PCR 기술은이 두 기술의 한계를 극복합니다., 우리가 다양한 인간 유전자를 감지하고 인간 유전자지도를 완성 할 수 있도록.
형광 현장 혼성화 (물고기)
형광은 현장 하이브리드 화는 형광 표지 된 프로브를 사용하여 간기에서 중기 또는 염색질에서 프로브와 염색체 사이의 혼성화를 검출하는 물리적 매핑 방법이다..
1980 년대 후반에 개발되었습니다, 어류는 방사성 인시 튜 하이브리드 화 기술로부터 동위 원소 표지를 형광 표지로 대체함으로써 비 방사성 분자 세포 유전 학적 기술로 진화했다.. 물고기에, 프로브는 먼저 리포터 분자와 결합됩니다, 이어서, 이후 하이브리드 화 후 면역 화학적 과정을 통해 형광 염료에 연결됩니다..
물고기의 기본 원리는 DNA를 표시하는 것입니다 (또는 RNA) 특수 뉴클레오티드 분자를 가진 프로브, 이들 프로브를 염색체 또는 DNA 섬유 섹션으로 직접 혼성화합니다., 및 형광 분자와 결합 된 단일 클론 항체를 사용하여 프로브 분자에 특이 적으로 결합합니다.. 이것은 질적을 허용합니다, 위치, 및 염색체 또는 DNA 섬유 섹션에서 DNA 서열의 상대적 정량 분석.
물고기는 안전을 제공합니다, 속도, 높은 감도, 장기 프로브 보존, 그리고 여러 색상을 동시에 표시하는 능력. 중단 염색체와 간기 핵을 모두 표시 할 수 있습니다. 뿐만 아니라, 다색 형광 in situ hybridization 및 염색질 섬유 형광 in situ 하이브리드 화 기술은 물고기를 기반으로 개발되었습니다..
을 위한 rRNA 현장 하이브리드 화 형광, 몇 가지 요인으로 인해 형광 신호 강도가 낮아질 수 있습니다:
- 낮은 세포 리보솜 함량
- 낮은 세포막 투과성
- RRNA 폴딩으로 인한 낮은 대상 서열 접근성, 일부 위치가 다른 사슬이나 단백질과 밀접하게 묶인 곳, 프로브가 목표 시퀀스로 혼성화되는 것을 방지합니다.
세포의 표적 서열이 프로브에 의해 쉽게 혼성화되는지 여부를 테스트하고 최적의 혼성화 온도를 결정합니다., “클론 피쉬” 사용할 수 있습니다: RRNA 유전자는 플라스미드에 혼입된다, e. 리보솜을 형성하는 대장균, 그런 다음 형광 표지 된 프로브로 혼성화했습니다.
물고기는 또한 유세포 분석과 결합하여 구체적으로 형광 표지 된 세포를 세거나 분리 할 수 있습니다..
