Solarbio Glutathione Peroksidase (GSH-Px/GPX) Kit Uji Aktivitas

Catatan: Ambil dua atau tiga sampel berbeda untuk prediksi sebelum pengujian.

Peralatan Operasi: Spektrofotometer

Kucing No: SM1190

Ukuran: 50T/24S

Komponen:

Reagen	Jumlah	Penyimpanan	Persiapan
Ekstrak larutan	30 mL × 1	4°C	–
Reagen I	Bubuk × 2	4°C	Menambahkan 3.3 mL Pengencer hingga larut saat digunakan.
Reagen II	10 μL × 1	4°C	Encerkan dengan 2 μL Reagen II dan 10 mL air suling sebelum digunakan.
Reagen III	60 mL × 1	4°C	Larutkan bagian bawah yang mengkristal dalam penangas air pada suhu 50°C. Gunakan supernatan jika bagian bawah masih mengkristal.
Reagen IV	30 mL × 1	4°C	–
Reagen V	10 mL × 1	4°C	–
Standar	Bubuk × 1	4°C	Menambahkan 0.405 mL air suling ke 10 mg glutathione tereduksi (GSH) saat digunakan.
pengencer	20 mL × 1	4°C	–

Deskripsi Produk:

• Glutathione peroksidase (GPX), juga dikenal sebagai GSH-Px atau GPX, adalah enzim peroksidase penting yang banyak ditemukan di tubuh.
• GPX memainkan peran penting dalam mengkatalisis konversi glutathione tereduksi (GSH) untuk mengoksidasi glutathione (GSSG) dan dalam mereduksi hidrogen peroksida beracun menjadi senyawa hidroksil tidak beracun.
• Tindakan enzimatik GPX melibatkan oksidasi GSH oleh hidrogen peroksida, menghasilkan produksi GSSG.
• GSH bereaksi dengan DTNB membentuk senyawa dengan karakteristik puncak serapan pada 412 nm.
• Penurunan serapan pada 412 nm berfungsi sebagai indikator aktivitas GPX.

Reagen dan Peralatan Diperlukan tetapi Tidak Disediakan:

Spektrofotometer, keseimbangan, mesin sentrifugal meja, 1 mL kuvet kaca, mortir/homogenizer, tabung EP.

Prosedur

SAYA. Persiapan sampel:

Jaringan:

Rasio kesesuaian Berat jaringan (G): Ekstrak larutan (ml)=1:5~10 (Disarankan 0,05g tisu dengan 1mL larutan Ekstrak), homogenkan dalam penangas es. Sentrifugasi di 5000 rpm pada 4℃ untuk 10 menit, ambil supernatannya, dan letakkan di atas es untuk diuji (Jika supernatannya tidak jernih, mesin sentrifugal untuk 3 menit).

Bakteri atau sel

Jumlah sel (104): Ekstrak larutan (ml): 500~1000:1 (Tambahkan 1mL larutan Ekstrak ke dalam 5 juta sel), ultrasonik dengan penangas es untuk menghancurkan sel(300W,3S, interval 7 detik,waktu keseluruhan 3 menit). Disentrifugasi pada 5000 rpm pada 4℃ untuk 10 menit, ambil supernatannya dan letakkan di atas es untuk diuji (Jika supernatannya tidak jernih, mesin sentrifugal untuk 3 menit).

Sampel serum: Deteksi secara langsung

II. Tekad prosedur:

1. Panaskan terlebih dahulu spektrofotometer untuk 30 menit, sesuaikan panjang gelombangnya 412 nm, dan setel nol dengan air suling.
2. Solusi standar dari 20 μmol/mL diencerkan menjadi 0.25 μmol/mL dengan larutan ekstraksi. Solusi standar dari 100 μL dicampur dengan 400 μL Reagen IV, dan konsentrasi larutan standarnya adalah 0.05 mol/mL. Larutan standar disiapkan ketika campuran larutan digunakan.
3. Campurkan 150 μL sampel dengan 150 μLof reagen I dan letakkan pada suhu kamar 5 menit.
4. Meja operasi: (1.5 mL tabung sentrifugal dengan reagen berikut secara bergantian).

Nama Reagen(μL)	Tabung reaksi (T)	Tabung kontrol (C)
Contoh Supernatan	100	–
Reagen I	100	100
Panaskan untuk 5 menit pada 37℃
Reagen II	50	50
Reaksi untuk 5 menit pada 37℃
Reagen III	1000	1000
Campuran sampel	–	100

Sentrifugasi di 4000 rpm pada suhu kamar selama 5 menit dan ambil supernatannya ke dalam tabung EP.

Nama Reagen(μL)	Tabung reaksi (T)	Tabung kontrol (C)	Tabung standar (S)	Tabung hitam (B)
pengencer	–	–	–	500
Supernatan	500	500	–	–
Campuran standar	–	–	500	–
Reagen IV	500	500	500	500
Reagen V	125	125	125	125

Campur dengan baik. Kemudian ditempatkan pada suhu kamar selama 15 menit, serapan di 412 nm diukur. Absorbansinya dicatat sebagai AT, AC, SEBAGAI, dan AB, masing-masing. Hitung ΔAT = AC – PADA, ΔSEBAGAI= SEBAGAI – AB.

AKU AKU AKU. Perhitungan:

Perhitungan persentase penghambatan Persentase penghambatan =(AC-AT)/(AC-AB)×100%

Sejauh mungkin, persentase penghambatan sampel berada dalam kisaran 30-70%, dan semakin dekat jaraknya 50%, semakin akurat itu. Jika persentase penghambatan kurang dari 30% atau lebih dari 70%, biasanya perlu menyesuaikan dosis dan menentukannya kembali. Jika persentase penghambatannya tinggi, sampel harus diencerkan dengan benar. Jika persentase penghambatannya rendah, sampel dengan konsentrasi tinggi harus disiapkan kembali.

Perhitungan aktivitas GPX

• Konsentrasi protein:

Definisi satuan: Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalisis oksidasi 1 nmol GSH per menit dalam sistem reaksi., setiap miligram protein.

GPX (U/mg keuntungan) =ΔAT(ΔSEBAGAICS)×1000×VEV(Cpr×VSV)T = 200×ΔAT ΔAS α Cpr

• Berat sampel

Definisi satuan: Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalisis oksidasi 1 nmol GSH per menit dalam sistem reaksi, setiap gram sampel.

GPX (berat U/g) =ΔAT(ΔSEBAGAICS)×1000×VEV(VSV.VTV×W)−T=200×ΔAT−ΔAS−W

• Jumlah sel

Definisi satuan: Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalisis oksidasi 1 nmol GSH per menit dalam sistem reaksi., setiap 104 sel.

GPX(U/104sel) =ΔAT(ΔSEBAGAICS)×1000×VEV(N×VSV±VTV)−T=200×ΔAT−ΔAS−N

• Volume cairan:

Definisi satuan: Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalisis oksidasi 1 nmol GSH per menit dalam sistem reaksi, setiap mililiter cairan.

GPX (U/mL)=ΔAT(ΔSEBAGAICS)×1000×VEV − VS − T = 200 × ΔAT ΔAS.

CS: Konsentrasi campuran standar, 0.08 mol/mL;

VEV: Volume sistem reaksi enzimatik, 1.25ml;

Vsv: Volume sampel yang terkandung dalam campuran sampel, 0.1 ml; VTV: Volume larutan ekstraksi, 1 ml;

Cpr: Konsentrasi protein supernatan, mg/mL;

T: Waktu reaksi, 5 menit;

N: Jumlah sel, puluhan ribu; W: Berat sampel, G;

1000: 1 mol = 1000 nmol.

Catatan:

1. Ketika serapannya lebih besar dari 1.2, Disarankan agar sampel ditentukan setelah diencerkan dengan ekstraksi
2. Disarankan untuk tidak mengambil terlalu banyak sampel sekaligus, untuk menghindari pengaruh waktu pengujian yang terlalu lama terhadap perkembangan warna, yang mungkin membiarkan tekadnya tidak

Contoh eksperimental：

• Ambil 0,1 gram hati tikus, tambahkan 1mL larutan ekstrak, homogenat, dan menggiling. Ambil supernatannya, encerkan dengan 40 waktu, dan uji sesuai pengukuran. Hitung AT=0,108, AC=0,303, AS=0,491AB=0,033,∆AT=AC-AT=0,195 ∆AS= AS-AB=0,458, menghitung aktivitas enzim berdasarkan berat sampel:

GPX (berat U/g)=200×ΔAT±ΔAS±W×40（rasio pengenceran）=34061 U/g.

• Ambil 1g daun poplar, tambahkan 1mL larutan ekstrak, homogenat, dan menggiling. Hitung AT=0,220, AC=0,318, SEBAGAI=0,491, AB=0,033, ∆AT=AC-AT=0,098,∆AS=AB-AB=0,458, menghitung aktivitas enzim berdasarkan berat sampel:

GPX (berat U/g)=200×ΔAT−ΔAS−W=428 U/g.