Bilješka: Uzmite dva ili tri različita uzorka za predviđanje prije testa.
Operativna oprema: Spektrofotometar
Mačka ne: BC1190
Veličina: 50T/24s
Komponente:
| Reagens | Iznositi | Skladištenje | Priprema |
|---|---|---|---|
| Otopina ekstrakta | 30 ml × 1 | 4°C | – |
| Reagens i | Prah × 2 | 4°C | Dodati 3.3 ml razrjeđivača da se otopi kada se koristi. |
| Reagens II | 10 μl × 1 | 4°C | Razrijediti sa 2 μl reagens II i 10 ML destilirana voda prije upotrebe. |
| Reagens iii | 60 ml × 1 | 4°C | Otopite kristalizirano dno u vodenoj kupelji na 50 ° C. Koristite supernatant ako dno ostane kristalizirano. |
| Reagens IV | 30 ml × 1 | 4°C | – |
| Reagens v | 10 ml × 1 | 4°C | – |
| Standard | Prah × 1 | 4°C | Dodati 0.405 ml destilirane vode do 10 Mg smanjenog glutationa (GSH) Kada se koristi. |
| Razrjeđivač | 20 ml × 1 | 4°C | – |
Opis proizvoda:
- Glutation peroksidaza (GPX), Poznat i kao GSH-PX ili GPX, je ključni enzim peroksidaze koji se široko nalazi u tijelu.
- GPX igra značajnu ulogu u kataliziranju pretvorbe smanjenog glutationa (GSH) na oksidirani glutation (GSSG) i pri smanjenju toksičnog vodikovog peroksida na netoksične hidroksilne spojeve.
- Enzimsko djelovanje GPX -a uključuje oksidaciju GSH -a vodikovim peroksidom, što rezultira proizvodnjom GSSG -a.
- GSH reagira s DTNB -om kako bi formirao spojeve s karakterističnim vrhovima apsorpcije na 412 NM.
- Smanjenje apsorpcije na 412 NM služi kao pokazatelj GPX aktivnosti.
Potrebni reagensi i oprema, ali nisu pruženi:
Spektrofotometar, uravnotežiti, stol centrifuga, 1 ML staklena kiveta, minobacač/homogenizator, EP cijev.
Postupak
Ja. Priprema uzorka:
Tkivo:
Omjer omjera u skladu s tkivom (g): Otopina ekstrakta (ml)= 1:5~ 10 (Predložio 0,05 g tkiva s 1 ml otopine ekstrakta), Homogenat na ledenoj kupelji. Centrifuga na 5000 RPM na 4 ℃ za 10 minuta, uzmi supernatanta, i stavite ga na led za test (Ako supernatant nije jasan, centrifuga za 3 minuta).
Bakterije ili stanice
Količina stanica (104): Otopina ekstrakta (ml): 500~ 1000:1 (Dodajte 1ml otopine ekstrakta u 5 milijun stanica), ultrazvučna s ledenom kupeljom za razbijanje ćelija(300W,3s, Interval 7s,ukupno vrijeme 3 minuta). Centrifugiran na 5000 RPM na 4 ℃ za 10 minuta, Uzmite supernatant i stavite ga na led za test (Ako supernatant nije jasan, centrifuga za 3 minuta).
Uzorak seruma: Otkrijte izravno
Ii. Odlučnost postupak:
- Zagrijte spektrofotometar za 30 minuta, Podesite valnu duljinu na 412 NM, i postaviti nulu s destiliranom vodom.
- Standardno rješenje 20 μmol/ml je razrijeđen do 0.25 μmol/ml s otopinom za ekstrakciju. Standardno rješenje 100 μl se miješa s 400 μl reagensa IV, a koncentracija standardne otopine bila je 0.05 μmol/ml. Standardna otopina se priprema kada se koristi smjesa otopine.
- Pomiješajte 150 μl uzorka s 150 μlof reagens I i stavite ga na sobnu temperaturu za 5 minuta.
- Operativna tablica: (1.5 ML centrifugalna cijev sa sljedećim reagensima zauzvrat).
| Ime reagensa(μL) | Epruveta (T) | Kontrola (C) |
| Uzorak supernatant | 100 | – |
| Reagens i | 100 | 100 |
| Zagrijte za 5 minuta u 37 ℃ | ||
| Reagens II | 50 | 50 |
| Reakcija na 5 minuta u 37 ℃ | ||
| Reagens iii | 1000 | 1000 |
| Uzorke smjesa | – | 100 |
Centrifuga na 4000 RPM na sobnoj temperaturi za 5 minute i odvedite supernatanta u EP cijev.
| Ime reagensa(μL) | Epruveta (T) | Kontrola (C) | Standard (S) | Crna cijev (B) |
| Razrjeđivač | – | – | – | 500 |
| Supernatant | 500 | 500 | – | – |
| Standardne smjese | – | – | 500 | – |
| Reagens IV | 500 | 500 | 500 | 500 |
| Reagens v | 125 | 125 | 125 | 125 |
Dobro miješajte. Zatim postavljen na sobnoj temperaturi za 15 minuta, apsorbancija na 412 NM se mjeri. Apsorbancija se bilježi kao na, Ac, KAO, I AB, odnosno. Izračunajte ΔAT = AC – NA, ΔAs = AS – Ab.
Iii. Izračunavanje:
Izračunavanje postotka inhibicije inhibitornog postotka =(Ac-at)/(Ab-ab)× 100%
Koliko god je to moguće, Postotak inhibicije uzorka je u rasponu od 30-70%, I što je bliže 50%, to je točniji. Ako je postotak inhibicije manji od 30% ili više od 70%, Obično je potrebno prilagoditi doziranje i ponovno ga deditirati. Ako je postotak inhibicije visok, Uzorak treba pravilno razrijediti. Ako je postotak inhibicije nizak, Uzorak s visokom koncentracijom treba ponovo pripremiti.
Izračun GPX aktivnosti
- Koncentracija proteina:
Definicija jedinice: Jedna jedinica aktivnosti enzima definirana je kao količina enzima koja katalizira oksidaciju 1NMOL GSH -a u minuti u reakcijskom sustavu, Svaki miligram proteina.
GPX (U/Mg Prot) = ΔAT ÷(Δas ÷ cs)× 1000 × vev ÷(CPR × VSV)÷ t = 200 × ΔAt ÷ ΔAs ÷ CPR
- Težina uzorka
Definicija jedinice: Jedna jedinica aktivnosti enzima definirana je kao količina enzima koja katalizira oksidaciju 1 NMOL GSH u minuti u reakcijskom sustavu, Svaki gram uzorka.
GPX (U/g težina) = ΔAT ÷(Δas ÷ cs)× 1000 × vev ÷(VSV ÷ VTV × W)÷ t = 200 × ΔAt ÷ ΔAs ÷ W
- Količina ćelije
Definicija jedinice: Jedna jedinica aktivnosti enzima definirana je kao količina enzima koja katalizira oksidaciju 1NMOL GSH -a u minuti u reakcijskom sustavu, svaki 104 stanice.
GPX(U/104cell) = ΔAT ÷(Δas ÷ cs)× 1000 × vev ÷(N × vsv ÷ vtv)÷ t = 200 × ΔAt ÷ ΔAs ÷ n
- Volumen tekućine:
Definicija jedinice: Jedna jedinica aktivnosti enzima definirana je kao količina enzima koja katalizira oksidaciju 1 NMOL GSH u minuti u reakcijskom sustavu, Svaki mililitar tekućine.
GPX (U/ml)= ΔAT ÷(Δas ÷ cs)× 1000 × vev ÷ vs ÷ t = 200 × ΔAt ÷ ΔAs.
Cs: Koncentracija standardnih smjesa, 0.08 μmol/ml;
Web mjesto: Volumen enzimskog reakcijskog sustava, 1.25ml;
VSV: Volumen uzorka sadržan u uzorcima smjesa, 0.1 ml; VTV: Volumen otopine za ekstrakciju, 1 ml;
CPR: Koncentracija supernatantnog proteina, mg/ml;
T: Vrijeme reakcije, 5 minuta;
N: Količina stanica, deseci tisuća; W: Težina uzorka, g;
1000: 1 μmol = 1000 nmol.
Bilješka:
- Kad je apsorbancija veća od 1.2, Predlaže se da se uzorak utvrdi nakon razrjeđivanja ekstrakcijom
- Preporučuje se ne uzimati previše uzoraka odjednom, Da biste izbjegli utjecaj predugog vremena testiranja na razvoj boja, što može dopustiti da odlučnost nije
Eksperimentalni slučajevi：
- Uzmite 0,1 g miša jetre, Dodajte 1ml otopine ekstrakta, homogenat, i mljevenje. Uzmi supernatanta, razrijediti ga 40 vrijeme, i testirati prema mjerenjima izračunavaju na = 0,108, AC = 0,303, AS = 0,491AB = 0,033, ∆AT = AC-AT = 0,195 ∆AS = AS-AB = 0,458, Izračunajte aktivnost enzima prema težini uzorka:
GPX (U/g težina)= 200 × ΔAT ÷ ΔAs ÷ W × 40 （Omjer razrjeđivanja） = 34061 U/G.
- Uzmi 1g topola, Dodajte 1ml otopine ekstrakta, homogenat, i mljevenje. Izračunajte na = 0,220, AC = 0,318, AS = 0,491, AB = 0,033, ∆AT = AC-AT = 0,098, ∆AS = AB-AB = 0,458, Izračunajte aktivnost enzima prema težini uzorka:
GPX (U/g težina)= 200 × ΔAT ÷ ΔAs ÷ W = 428 U/G.
Recenzije
Još nema recenzija.