Nota: Tome dos o tres muestras diferentes para predecir antes de la prueba..
Equipo de operación: espectrofotómetro
No gato: antes de Cristo1190
Tamaño: 50T/24S
Componentes:
| Reactivo | Cantidad | Almacenamiento | Preparación |
|---|---|---|---|
| Extraer solución | 30 mililitros × 1 | 4°C | – |
| reactivo yo | Polvo × 2 | 4°C | Agregar 3.3 mL de diluyente para disolver cuando se use. |
| Reactivo II | 10 µL × 1 | 4°C | Diluir con 2 µL de reactivo II y 10 mL de agua destilada antes de su uso.. |
| Reactivo III | 60 mililitros × 1 | 4°C | Disolver el fondo cristalizado en baño maría a 50°C.. Usar sobrenadante si el fondo permanece cristalizado.. |
| Reactivo IV | 30 mililitros × 1 | 4°C | – |
| Reactivo V | 10 mililitros × 1 | 4°C | – |
| Estándar | Polvo × 1 | 4°C | Agregar 0.405 mL de agua destilada para 10 mg de glutatión reducido (GSH) cuando se usa. |
| Diluente | 20 mililitros × 1 | 4°C | – |
Descripción del Producto:
- Peróxido de glutation (GPX), también conocido como GSH-Px o GPX, Es una enzima peroxidasa crucial que se encuentra ampliamente en el cuerpo..
- GPX juega un papel importante en catalizar la conversión de glutatión reducido (GSH) al glutatión oxidado (GSSG) y en la reducción del peróxido de hidrógeno tóxico a compuestos hidroxilo no tóxicos..
- La acción enzimática de GPX implica la oxidación de GSH por peróxido de hidrógeno., resultando en la producción de GSSG.
- GSH reacciona con DTNB para formar compuestos con picos de absorción característicos en 412 Nuevo Méjico.
- La disminución de la absorbancia en 412 nm sirve como indicador de la actividad GPX.
Reactivos y equipos necesarios pero no suministrados:
espectrofotómetro, balance, centrífuga de mesa, 1 cubeta de vidrio de ml, mortero/homogeneizador, tubo EP.
Procedimiento
I. preparación de la muestra:
Tejido:
Relación de concordancia Peso del tejido (gramo): Extraer solución (mililitros)=1:5~10 (Se recomiendan 0,05 g de tejido con 1 ml de solución de extracto.), homogeneizar en baño de hielo. Centrifugar en 5000 rpm a 4 ℃ para 10 minutos, tomar el sobrenadante, y colóquelo en hielo para probarlo. (Si el sobrenadante no es claro, centrífuga para 3 minutos).
Bacterias o células
cantidad de celulas (104): Extraer solución (mililitros): 500~1000:1 (Agregue 1 ml de solución de extracto a 5 millones de células), Ultrasónico con baño de hielo para romper células.(300W.,3s, intervalo 7s,Tiempo Total 3 minutos). Centrifugado en 5000 rpm a 4 ℃ para 10 minutos, tomar el sobrenadante y colocarlo en hielo para realizar la prueba (Si el sobrenadante no es claro, centrífuga para 3 minutos).
muestra de suero: Detectar directamente
II. Determinación procedimiento:
- Precalentar el espectrofotómetro durante 30 minutos, ajustar la longitud de onda a 412 Nuevo Méjico, y poner a cero con agua destilada.
- La solución estándar de 20 Se diluyó µmol/mL a 0.25 μmol/mL con la solución de extracción. La solución estándar de 100 Se mezcla µL con 400 μL de reactivo IV, y la concentración de la solución estándar fue 0.05 µmol/mL. La solución estándar se prepara cuando se utiliza la mezcla de solución..
- Mezclar el 150 μL de muestra con el 150 μL del reactivo I y colocarlo a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- mesa de operaciones: (1.5 Tubo centrífugo de mL con los siguientes reactivos por turno.).
| Nombre del reactivo(µL) | Tubo de ensayo (t) | tubo de control (C) |
| Sobrenadante de muestra | 100 | – |
| reactivo yo | 100 | 100 |
| Precalentar para 5 minutos a 37 ℃ | ||
| Reactivo II | 50 | 50 |
| Reacción por 5 minutos a 37 ℃ | ||
| Reactivo III | 1000 | 1000 |
| Mezclas de muestra | – | 100 |
Centrifugar en 4000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos y llevar el sobrenadante a un tubo EP.
| Nombre del reactivo(µL) | Tubo de ensayo (t) | tubo de control (C) | tubo estándar (S) | tubo negro (B) |
| Diluente | – | – | – | 500 |
| Flotante | 500 | 500 | – | – |
| Mezclas estándar | – | – | 500 | – |
| Reactivo IV | 500 | 500 | 500 | 500 |
| Reactivo V | 125 | 125 | 125 | 125 |
bien mezclar. Luego se coloca a temperatura ambiente durante 15 minutos, la absorbancia en 412 se mide nm. La absorbancia se registra como AT, C.A., COMO, y AB, respectivamente. Calcular ΔAT = CA – EN, ΔAS= AS – AB.
III. Cálculo:
Cálculo del porcentaje de inhibición Porcentaje inhibidor =(UN GATO)/(AC-AB)×100%
Tan lejos como sea posible, el porcentaje de inhibición de la muestra está dentro del rango de 30-70%, y cuanto más cerca esté de 50%, cuanto más preciso sea. Si el porcentaje de inhibición es menor que 30% o más de 70%, Generalmente es necesario ajustar la dosis y volver a determinarla.. Si el porcentaje de inhibición es alto, la muestra debe diluirse adecuadamente. Si el porcentaje de inhibición es bajo, la muestra con una concentración alta debe prepararse nuevamente.
Cálculo de la actividad GPX.
- Concentración de proteínas:
Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la oxidación de 1 nmol de GSH por minuto en el sistema de reacción., cada miligramo de proteína.
GPX (Prot. U/mg) =ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷(RCP×VSV)÷T=200×ΔAT÷ΔAS÷Cpr
- Peso de la muestra
Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la oxidación de 1 nmol de GSH por minuto en el sistema de reacción, cada gramo de muestra.
GPX (Peso U/g) =ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷(VSV÷VTV×W)÷T=200×ΔAT÷ΔAS÷W
- cantidad de celda
Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la oxidación de 1 nmol de GSH por minuto en el sistema de reacción., cada 104 células.
GPX(U/104 celdas) =ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷(N×VSV÷VTV)÷T=200×ΔAT÷ΔAS÷N
- Volumen de liquido:
Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la oxidación de 1 nmol de GSH por minuto en el sistema de reacción, cada mililitro de líquido.
GPX (unidades/mL)=ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷VS÷T=200×ΔAT÷ΔAS.
CS: Concentración de mezclas estándar., 0.08 µmol/mL;
VEV: Volumen del sistema de reacción enzimática., 1.25mililitros;
vsv: Volumen de muestra contenido en mezclas de muestras., 0.1 mililitros; Vtv: Volumen de solución de extracción, 1 mililitros;
RCP: Concentración de proteína sobrenadante, mg/mL;
t: Tiempo de reacción, 5 minutos;
norte: La cantidad de células, Decenas de miles; W.: Peso de la muestra, gramo;
1000: 1 µmol=1000 nmol.
Nota:
- Cuando la absorbancia es mayor que 1.2, Se sugiere que la muestra se determine después de diluirla con el extractor.
- Se recomienda no tomar demasiadas muestras a la vez., para evitar la influencia de un tiempo de prueba demasiado largo en el desarrollo del color, lo que puede permitir que la determinación no sea
Instancias experimentales：
- Tome 0,1 g de hígado de ratón., agregue 1 ml de solución de extracto, homogeneizar, y moler. tomar el sobrenadante, diluirlo por 40 veces, y probar según las mediciones Calcular AT=0,108, CA=0,303, AS=0.491AB=0.033,∆AT=AC-AT=0.195 ∆AS= AS-AB=0.458, calcular la actividad enzimática según el peso de la muestra:
GPX (Peso U/g)=200×ΔAT÷ΔAS÷W×40（relación de dilución）=34061 U/g.
- Tomar 1g de hoja de álamo., agregue 1 ml de solución de extracto, homogeneizar, y moler. Calcular AT=0,220, CA=0,318, AS=0,491, AB=0,033, ∆AT=AC-AT=0,098,∆AS=AB-AB=0,458, calcular la actividad enzimática según el peso de la muestra:
GPX (Peso U/g)=200×ΔAT÷ΔAS÷W=428 U/g.
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