Kit d'analyse HPLC de contenu Solarbio ATP ADP AMP 50T | 48S

Note: Prélevez deux ou trois échantillons différents pour la prédiction avant le test. Équipement d'exploitation: Chromatographie liquide haute performance Numéro de catalogue: BC5114

Tailles：50T/48S

Composants:

Extraire la solution I: 80 mL×1. Stockage à 2-8℃.

Extraire la solution II：40 mL×1. Stockage à 2-8℃.

Réactif I: 15 mL×1. Stockage à 2-8℃. Avant utilisation, prendre 3.5 mL de réactif I et l'ajouter à 1000 mL d'eau ultra pure, ajuster son pH à 6.15 avec le réactif II pour former la phase mobile B, et scelle-le.

Réactif II:10 ml × 1. Stockage à 2-8℃.

Norme ATP： Poudre × 1. Stockage à -20℃. Avant utilisation, 1.8 mL d'eau distillée est ajouté pour préparer 1 μmol / mL de solution étalon d'ATP, qui a été congelé à -20 °C. Pour garantir l’intégrité de l’ATP, éviter les congélations et décongélations répétées.

Norme ADP： Poudre × 1. Stockage à -20℃. Avant utilisation, 2.34 mL d'eau distillée est ajouté pour préparer 1 μmol / mL de solution étalon d'ATP, qui a été congelé à -20 °C. Pour garantir l’intégrité de l’ATP, éviter les congélations et décongélations répétées.

Norme AMP： Poudre × 1. Stockage à -20℃. Avant utilisation, 2.0 mL d'eau distillée est ajouté pour préparer 1 μmol / mL de solution étalon d'ATP, qui a été congelé à -20 °C. Pour garantir l’intégrité de l’ATP, éviter les congélations et décongélations répétées.

Description du produit：

Les nucléotides ont des fonctions biologiques importantes. Il s'agit d'une classe de composés composés de trois substances: base purique ou base pyrimidique, ribose ou désoxyribose, et acide phosphorique. Ils participent principalement à la formation des nucléosides.

Adénosine triphosphate (ATP) est considérée comme une source d’énergie universelle essentielle à la synthèse cellulaire pour la survie et la reproduction de tous les organismes. L'ATP peut être produit par diverses voies cellulaires. L'exemple le plus typique est la synthèse par l'adénosine triphosphate synthase par phosphorylation oxydative dans les mitochondries., ou synthèse par photosynthèse dans les chloroplastes végétaux. Les principales sources d'énergie pour la synthèse de l'ATP sont le glucose et les acides gras..

Adénosine diphosphate (ADP) est largement présent chez les animaux, plantes, micro-organismes, et cellules cultivées. Dans les organismes, L'ADP est le produit de la rupture d'une liaison phosphate à haute énergie (ATP) hydrolysé pour perdre un radical phosphate) et libérer de l'énergie.

Adénosine monophosphate (AMP) est largement trouvé chez les animaux, plantes, micro-organismes, et cellules cultivées. Il se forme après que l'ATP et l'ADP libèrent de l'énergie dans le corps.. Il peut continuer à se lier aux groupes phosphate pour former de l'adénosine diphosphate. (ADP) et adénosine triphosphate (ATP). C'est le produit de l'hydrolyse incomplète de l'ATP.

ATP 、 ADP 、 L'AMP a un pic d'absorption à 254 nm, et leur contenu peut être déterminé par chromatographie liquide haute performance.

Réactifs et équipements requis mais non fournis：

Chromatographe liquide à haut rendement (Colonne C18 (4.6×250mm), détecteur ultraviolet (VW)), centrifugeuse de bureau, pipette réglable, mortier/homogénéisateur, tube EP marron, 50 filtres pour seringues (eau, 0.45

µm), seringue, filtre d'aspiration, membrane filtrante (organique, eau), 50 flacon d'injection marron (2 ml), acétonitrile (chromatographiquement pur, 500 ml), eau ultra pure.

Préparatifs avant l'expérience:

1. Utiliser 500 mL d'acétonitrile chromatographiquement pur (phase mobile A) et 1000 mL de phase mobile B configurée à filtrer avec une membrane filtrante pour éliminer les impuretés du solvant afin d'éviter de boucher la colonne chromatographique. (L'acétonitrile utilise un 0.45 Membrane filtrante organique µm pour filtration par aspiration, et la phase mobile configurée B utilise un 0.22 Membrane filtrante aqueuse µm pour filtration par aspiration).
2. Echographier les phases mobiles A et B préparées pour 30 minutes pour éliminer le gaz dans le solvant afin d'éviter de boucher la colonne chromatographique et d'affecter l'expérience
3. Préparation de Norme ATP: 1 La solution étalon μmol/mL d’ATP est diluée avec de l’eau distillée pour 0.5 µmol/mL, 0.1 µmol/mL, 0.05 µmol/mL, 0.01 µmol/mL, 0.005 Solution étalon d'ATP μmol/mL. (La concentration standard préparée est uniquement à titre de référence et peut être ajustée en fonction de la concentration réelle de l'échantillon.). L'étalon est filtré à l'aide d'un filtre seringue aqueux dans le flacon d'injection marron à tester. (veuillez le placer à température ambiante avant de tester, afin de ne pas affecter le temps de rétention).
4. Préparation de Norme ADP: 1 La solution étalon d’ADP μmol/mL est diluée avec de l’eau distillée pour 0.5 µmol/mL, 0.1 µmol/mL, 0.05 µmol/mL, 0.01 µmol/mL, 0.005 Solution étalon d'ADP µmol/mL. (La concentration standard préparée est uniquement à titre de référence et peut être ajustée en fonction de la concentration réelle de l'échantillon.). L'étalon est filtré à l'aide d'un filtre seringue aqueux dans le flacon d'injection marron à tester. (veuillez le placer à température ambiante avant de tester, afin de ne pas affecter le temps de rétention).
5. Préparation de Norme AMP: 1 La solution étalon μmol/mL d’AMP est diluée avec de l’eau distillée pour

0.5 µmol/mL, 0.1 µmol/mL, 0.05 µmol/mL, 0.01 µmol/mL, 0.005 Solution étalon AMP μmol/mL. (La concentration standard préparée est uniquement à titre de référence et peut être ajustée en fonction de la concentration réelle de l'échantillon.). L'étalon est filtré à l'aide d'un filtre seringue aqueux dans le flacon d'injection marron à tester. (veuillez le placer à température ambiante avant de tester, afin de ne pas affecter le temps de rétention).

Procédure

1. La préparation des échantillons:

• • Échantillon de tissu: Selon le rapport des tissus (g): extraire la solution I (ml) = 1:5~10 (il est recommandé de peser 3 g d'échantillon de tissu et ajouter 1.5 mL de solution d'extrait I) ajouter la solution d'extrait I, homogénéiser sur glace, et extraire dans un bain de glace pendant 40 min. Centrifuger à 10000 tr/min pour 10 min à 4°C, prélever 750μL du surnageant, ajouter 750μL d'extrait II, secouez bien (5 min) et bien mélanger, centrifuger à nouveau à 10000 tr/min à 4°C pendant 10 min, et prendre le surnageant à filtrer avec un filtre seringue aqueux dans le flacon d'injection marron à tester à température ambiante (dans 2 h).
  • Échantillon de cellules: Selon le rapport de 10 millions de cellules (unités): extraire la solution I (ml)= 1000~500:1 (il est recommandé de prendre 10 millions d'échantillons de cellules et ajoutez 1 mL de solution d'extrait I) ajouter la solution d'extraction I, Cellules brisées par ultrasons sur la glace (puissance 300W, échographie pour 3 secondes, intervalle de 7 secondes, temps total de 3 minutes); centrifuger à 4℃, 10000 tr/min pour 10 minutes, prélever 750μL du surnageant, ajouter 750μL d'extrait II, secouez bien (5 min) et bien mélanger, centrifuger à nouveau à 10000 tr/min à 4°C pendant 10 min, et prendre le surnageant à filtrer avec un filtre seringue aqueux dans le flacon d'injection marron à tester à température ambiante (dans les 2h).
  • Sérum: Il est recommandé de prendre 0.4 mL d'échantillon de sérum, ajouter 0.6 mL de solution d'extraction 1, et extrait pour 40 min dans un bain de glace. Centrifuger à 10000 tr/min pour 10 min à 4°C, prélever 750μL du surnageant, ajouter 750μL d'extrait II, secouez bien (5 min) et bien mélanger, centrifuger à nouveau à 10000 tr/min à 4°C pendant 10 min, et prendre le surnageant à filtrer avec un filtre seringue aqueux dans le flacon d'injection marron à tester à température ambiante (dans les 2h).

2. Détermination procédure：

1. Allumez l'ordinateur, allumer les boutons de commutation de chaque module de la HPLC, installer la colonne chromatographique, ouvrez le logiciel, et réglez le volume d'injection dans le groupe de méthodes sur 10 µL, température de la colonne: 27°C, débit 0.8 mL/min, et longueur d'onde 254 nm, le programme d'élution est tel qu'indiqué dans le tableau ci-dessous, et le temps d'échantillonnage est 70 min. Après avoir réglé, enregistrer le groupe de méthodes.
2. Nettoyer la colonne avec la phase mobile, équilibrer la colonne avec un rapport de phase mobile d'acétonitrile: phase mobile B (pH = 6.15) = 2: 98, et commencez l'injection une fois que la ligne de base est stable.
3. Détecter la solution étalon préparée, le volume d'injection est 10 µL, l'ATP, ADP, et AMP peuvent être séparés dans 10 minutes, et le temps de rétention de l'ATP, ADP, et AMP concerne 7.8 min, 6.7minutes et 5,4 minutes (le pH du système, colonne, phase mobile, etc.. sont différents, le temps de rétention est différent, seule référence).
4. Détecter la solution échantillon préparée, le volume d'injection est 10 µL, et détecter la zone de pic d'ATP, ADP, et AMP à la rétention correspondante

Temps		Phase mobile
	UN		B
0 min	2%		98%
10 min	2%		98%
15 min	70%		30%
50 min	70%		30%
55 min	2%		98%
70 min	2%		98%

3. Calculs：

1. Dessiner des courbes standards de l'ATP, ADP, AMP avec la concentration standard (µmol/mL) comme x et l'aire du pic comme y. Remplacez la surface du pic de l'échantillon par la courbe standard pour calculer l'ATP., ADP, Concentration en AMP x1, x2, x3 (µmol/mL) dans le

Teneur en ATP calcul

1. Poids de l'échantillon

ATP (μmol / g)＝2 x1×VE÷W=3 x1÷W

ATP (μg/g）=2 x1 ×VE×551,14 ÷W=1653,42 x1÷W

VE: volume de solution d'extrait I, 1.5ml; W: Poids de l'échantillon, g; MATP: 551.14; 2: Facteur de dilution de l'échantillon.

1. Volume de liquide:

ATP (µmol/mL)＝2 x1 ×VE÷VS=5×x1

ATP (μg/mL）=2 x1 ×VE×551,14 ÷VS =2755,7 ×x1

VE: volume de solution d'extrait I, 1ml; MATP: 551.14; CONTRE： volume d'échantillon, 0.4ml； 2: Facteur de dilution de l'échantillon.

1. Quantité de cellules

ATP (µmol/104 cellule)＝2 x1 ×VE÷ N =2×x1÷ N

ATP (μg/g104 cellule）=2 x1 ×VE×551,14 ÷N =1102,28×x1÷N

VE: volume de solution d'extrait I, 1ml; MATP: 551.14; N: nombre de cellules, 104 comme une unité; 2: Facteur de dilution de l'échantillon.

Contenu ADP calcul

1. Poids de l'échantillon

ADP (μmol / g)＝2 x2×VE÷W=3 x2÷W

ADP (μg/g）=2 x2 ×VE×427,2 ÷W=1281,6 x2÷W

VE: volume de solution d'extrait I, 1.5ml; W: Poids de l'échantillon, g; MADP: 427.2; 2: Facteur de dilution de l'échantillon.

1. Volume de liquide:

ADP (µmol/mL)＝2 x2 ×VE÷VS=5×2

ADP (μg/mL）=2 x2 ×VE×427,2÷VS =2136×x2

VE: volume de solution d'extrait I, 1ml; MADP: 427.2; CONTRE： volume d'échantillon, 0.4ml； 2: Facteur de dilution de l'échantillon.

1. Quantité de cellules

ADP (µmol/104 cellule)＝2 x2 ×VE÷N =0,002×2÷N

ADP (μg/g104 cellule）=2 x2 ×VE×427,2 ÷N =854,4×x2÷N

VE: volume de solution d'extrait I, 1ml; MADP: 427.2; N: nombre de cellules, 104 comme une unité; 2: Facteur de dilution de l'échantillon.

Contenu AMP calcul

1. Poids de l'échantillon

AMP (μmol / g)＝2 x3×VE÷W=3 x3÷W

AMP (μg/g）=2 x3 ×VE×499,19÷W=1497,57×3÷W

VE: volume de solution d'extrait I, 1.5ml; W: Poids de l'échantillon, g; MAMP: 499.19; 2: Facteur de dilution de l'échantillon.

1. Volume de liquide:

AMP (µmol/mL)＝2 x3 ×VE÷VS=5×x3

AMP (μg/mL）=2 x3 ×VE×499,19÷VS =2495,95×x3

VE: volume de solution d'extrait I, 1ml; MAMP: 499.19; CONTRE： volume d'échantillon, 0.4ml； 2: Facteur de dilution de l'échantillon.

1. Quantité de cellules

AMP (µmol/104 cellule)＝2 x3 ×VE÷N =2×x3÷N

AMP (μg/g104 cellule）=2 x3 ×VE×499,19 ÷N =998,38×x3÷N

VE: volume de solution d'extrait I, 1ml; MAMP: 499.19; N: nombre de cellules, 104 comme une unité; 2: Facteur de dilution de l'échantillon.

Note:

Précautions:

1. Après la détection, la colonne chromatographique doit être rincée avec de l'eau ultrapure à haute concentration (à propos 20-30 volumes de colonnes) pour éviter de boucher la colonne chromatographique. Enfin, rincer la colonne conformément aux spécifications de la colonne pour éviter d'endommager l'image chromatographique
2. Le facteur de dilution de l'étalon doit être déterminé en fonction de la concentration de nucléotides dans l'échantillon. La zone du pic des nucléotides dans l'échantillon doit se situer dans la zone du pic de la solution étalon de différentes concentrations.. Le facteur de dilution de l'étalon n'est qu'une référence. Si la concentration de nucléotides dans l'échantillon est trop élevée, il est recommandé de le diluer avant
3. L'échantillon après extraction n'est pas stable à température ambiante, il faut donc l'opérer le plus tôt possible.
4. Si le nombre d'échantillons est trop grand, il est recommandé de tester la solution étalon une fois par jour (une solution étalon suffit) déterminer la rétention correspondante