注記: テスト前に予測のために 2 つまたは 3 つの異なるサンプルを採取します. 操作装置: 高性能液体クロマトグラフィー カタログ番号: BC5114
サイズ：50T/48S
コンポーネント:
抽出ソリューションi: 80 mL×1. 2-8のストレージ.
抽出ソリューションII：40 mL×1. 2-8のストレージ.
試薬I: 15 mL×1. 2-8のストレージ. ご使用の前に, 取る 3.5 試薬Iのmlとそれを追加します 1000 超純水のml, そのpHを調整します 6.15 試薬IIを使用して移動相b, そしてそれを封印します.
試薬II:10 mL×1. 2-8のストレージ.
ATP標準： パウダー×1. -20℃で保管. ご使用の前に, 1.8 ML蒸留水が追加されます 1 μモル / ML ATP標準ソリューション, で凍っていた -20 ℃. ATPの完全性を確保するため, 繰り返しの凍結と解凍を避けてください.
ADP標準： パウダー×1. -20℃で保管. ご使用の前に, 2.34 ML蒸留水が追加されます 1 μモル / ML ATP標準ソリューション, で凍っていた -20 ℃. ATPの完全性を確保するため, 繰り返しの凍結と解凍を避けてください.
AMP標準： パウダー×1. -20℃で保管. ご使用の前に, 2.0 ML蒸留水が追加されます 1 μモル / ML ATP標準ソリューション, で凍っていた -20 ℃. ATPの完全性を確保するため, 繰り返しの凍結と解凍を避けてください.
製品説明：
ヌクレオチドには重要な生物学的機能があります. それらは3つの物質で構成される化合物のクラスです: プリンベースまたはピリミジンベース, リボースまたはデオキシリボース, およびリン酸. それらは主にヌクレオシドの形成に関与しています.
アデノシン三リン酸 (ATP) すべての生物の生存と繁殖における細胞合成に不可欠な普遍的なエネルギー源であると考えられています. ATPは、さまざまな細胞経路を通じて生成できます. 最も典型的な例は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を介したアデノシン三リン酸シンターゼによる合成です, または植物葉緑体の光合成による合成. ATP合成の主なエネルギー源はグルコースと脂肪酸です.
アデノシン二リン酸 (ADP) 動物に広く存在しています, 植物, 微生物, そして培養細胞. 生物で, ADPは、高エネルギーリン酸塩結合を破る製品です (ATP) 加水分解して、リン酸ラジカルを失いました) エネルギーを解放します.
アデノシン単リン酸 (アンプ) 動物に広く見られる, 植物, 微生物, そして培養細胞. ATPとADPが体内のエネルギーを放出した後に形成されます. リン酸基に結合し続けてアデノシン二リン酸を形成することができます (ADP) アデノシン三リン酸 (ATP). これは、ATPの不完全な加水分解の産物です.
ATP 、 ADP 、 アンプには吸収ピークがあります 254 nm, そしてそれらの内容は、高性能液体クロマトグラフィーによって決定できます.
必要だが提供されていない試薬と装置：
高効率液体クロマトグラフ (C18列 (4.6×250 mm), 紫外線検出器 (VWD)), デスクトップ遠心分離機, 調整可能なピペット, モルタル/ホモジナイザー, 茶色のEPチューブ, 50 シリンジフィルター (水, 0.45
µm), シリンジ, 吸引フィルター, フィルター膜 (オーガニック, 水), 50 茶色の注入ボトル (2 mL), アセトニトリル (クロマトグラフィー的に純粋, 500 mL), 超純水.
実験前の準備:
- 使用 500 クロマトグラフィー的に純粋なアセトニトリルのml (移動相a) そして 1000 構成された移動相BのMLは、溶剤の不純物を除去するフィルター膜でフィルターして、クロマトグラフィーカラムの詰まりを防ぐために. (アセトニトリルはaを使用します 0.45 吸引ろ過のためのµM有機フィルター膜, 構成された移動相Bはaを使用します 0.22 吸引ろ過のためのµM水性フィルター膜).
- 準備された携帯フェーズAおよびBのための超音波 30 クロマトグラフィーカラムの詰まりと実験に影響を与えるのを防ぐために、溶媒のガスを除去する分
- の準備 ATP標準: 1 μmol/ml ATP標準溶液を蒸留水で希釈します 0.5 μmol/mL, 0.1 μmol/mL, 0.05 μmol/mL, 0.01 μmol/mL, 0.005 μmol/ml ATP標準溶液. (準備された標準濃度は参照用でのみであり、実際のサンプル濃度に従って調整できます). 標準は、水性シリンジフィルターを使用して茶色の注入ボトルにろ過してテストします (テストする前に室温で配置してください, 保持時間に影響を与えないように).
- の準備 ADP標準: 1 μmol/ml ADP標準溶液を蒸留水で希釈します 0.5 μmol/mL, 0.1 μmol/mL, 0.05 μmol/mL, 0.01 μmol/mL, 0.005 μmol/ml ADP標準ソリューション. (準備された標準濃度は参照用でのみであり、実際のサンプル濃度に従って調整できます). 標準は、水性シリンジフィルターを使用して茶色の注入ボトルにろ過してテストします (テストする前に室温で配置してください, 保持時間に影響を与えないように).
- の準備 AMP標準: 1 μmol/ml AMP標準溶液を蒸留水で希釈します
0.5 μmol/mL, 0.1 μmol/mL, 0.05 μmol/mL, 0.01 μmol/mL, 0.005 μmol/ml AMP標準ソリューション. (準備された標準濃度は参照用でのみであり、実際のサンプル濃度に従って調整できます). 標準は、水性シリンジフィルターを使用して茶色の注入ボトルにろ過してテストします (テストする前に室温で配置してください, 保持時間に影響を与えないように).
手順
1. サンプルの準備:
-
- 組織サンプル: 組織の比率に応じて (g): 抽出ソリューションi (mL) = 1:5~10 (重さを量ることをお勧めします 3 g組織のサンプルと追加 1.5 ML抽出ソリューションi) 抽出ソリューションを追加するにはi, 氷上でホモジン酸塩, 氷浴に抽出します 40 分. で遠心分離します。 10000 の回転数 10 4°Cで分, 750μlの上清を服用します, 750μlの抽出物IIを追加します, よく振る (5 分) よく混ぜます, 再び遠心分離機 10000 4°CのRPM 10 分, そして、上清を茶色の注入ボトルに水溶性シリンジフィルターでろ過するためにろ過するために、室温でテストするためにろ過します (内で 2 h).
- 細胞サンプル: の比率に応じて 10 百万個の細胞 (単位): 抽出ソリューションi (mL)= 1000〜500:1 (取ることをお勧めします 10 百万のセルサンプルと追加 1 ML抽出ソリューションi) 抽出ソリューションを追加i, 氷上の超音波破壊細胞 (パワー300W, 超音波 3 秒, の間隔 7 秒, の合計時間 3 分); 4℃での遠心, 10000 の回転数 10 分, 750μlの上清を服用します, 750μlの抽出物IIを追加します, よく振る (5 分) よく混ぜます, 再び遠心分離機 10000 4°CのRPM 10 分, そして、上清を茶色の注入ボトルに水溶性シリンジフィルターでろ過するためにろ過するために、室温でテストするためにろ過します (2時間以内).
- 血清: 取ることをお勧めします 0.4 ML血清サンプル, 追加 0.6 ML抽出ソリューション 1, の抽出 40 アイスバスで分. で遠心分離します。 10000 の回転数 10 4°Cで分, 750μlの上清を服用します, 750μlの抽出物IIを追加します, よく振る (5 分) よく混ぜます, 再び遠心分離機 10000 4°CのRPM 10 分, そして、上清を茶色の注入ボトルに水溶性シリンジフィルターでろ過するためにろ過するために、室温でテストするためにろ過します (2時間以内).
2. 決定 手順：
- コンピューターをオンにします, HPLCの各モジュールのスイッチボタンをオンにします, クロマトグラフィー列を取り付けます, ソフトウェアを開きます, メソッドグループの注入量を10µlに設定します, 列温度: 27℃, 流量 0.8 ml/min, および波長 254 nm, 溶出プログラムは、下の表に示されているとおりです, サンプリング時間はです 70 分. 設定後, メソッドグループを保存します.
- 移動相で列を掃除します, アセトニトリルの移動相比でカラムを平衡化する: 移動相b (ph = 6.15) = 2: 98, ベースラインが安定した後、注入を開始します.
- 準備された標準ソリューションを検出します, 注入量はです 10 μL, ATP, ADP, アンプは内で分離できます 10 分, ATPの保持時間, ADP, とアンプは約です 7.8 分, 6.7分と5.4分 (システムのpH, カラム, 移動相, 等. 違う, 保持時間は異なります, 参照のみ).
- 準備されたサンプルソリューションを検出します, 注入量はです 10 μL, ATPのピーク領域を検出します, ADP, 対応する保持時のアンプ
| 時間 | 移動相 | ||
| あ | B | ||
| 0 分 | 2% | 98% | |
| 10 分 | 2% | 98% | |
| 15 分 | 70% | 30% | |
| 50 分 | 70% | 30% | |
| 55 分 | 2% | 98% | |
| 70 分 | 2% | 98% |
3. 計算：
- ATPの標準曲線を描きます, ADP, 標準濃度のあるアンプ (μmol/mL) xとして、ピーク領域としてyとして. サンプルのピーク領域を標準曲線に置き換えて、ATPを計算します, ADP, アンプ濃度x1, x2, x3 (μmol/mL) で
ATPコンテンツ 計算
- サンプル重量
ATP (μmol/g)＝2 x1×ve÷w = 3 x1÷w
ATP (μg/g） = 2 x1×ve×551.14÷w = 1653.42 x1÷w
ve: 抽出溶液の量i, 1.5mL; W: サンプル重量, g; MATP: 551.14; 2: サンプル希釈係数.
- LiquidVolume:
ATP (μmol/mL)＝ 2 x1×ves = 5×x1
ATP (μg/ml
ve: 抽出溶液の量i, 1mL; MATP: 551.14; VS： サンプルの量, 0.4mL； 2: サンプル希釈係数.
- 細胞量
ATP (μmol/104セル)＝2 x1×ve÷n = 2×x1÷n
ATP (μg/g104細胞）= 2 x1×ve×551.14÷n = 1102.28×x1÷n
ve: 抽出溶液の量i, 1mL; MATP: 551.14; N: セル数, 104 ユニットとして; 2: サンプル希釈係数.
ADPコンテンツ 計算
- サンプル重量
ADP (μmol/g)＝2 x2×ve÷w = 3 x2÷w
ADP (μg/g） = 2 x2×ve×427.2÷w = 1281.6 x2÷w
ve: 抽出溶液の量i, 1.5mL; W: サンプル重量, g; madp: 427.2; 2: サンプル希釈係数.
- LiquidVolume:
ADP (μmol/mL)＝2 x2 x ve÷vs = 5 x2
ADP (μg/ml
ve: 抽出溶液の量i, 1mL; madp: 427.2; VS： サンプルの量, 0.4mL； 2: サンプル希釈係数.
- 細胞量
ADP (μmol/104セル)＝2 x2 x ve÷n = 0.002 x2÷n
ADP (μg/g104細胞）= 2 x2×ve×427.2÷n = 854.4×x2÷n
ve: 抽出溶液の量i, 1mL; madp: 427.2; N: セル数, 104 ユニットとして; 2: サンプル希釈係数.
AMPコンテンツ 計算
- サンプル重量
アンプ (μmol/g)＝2 x3×ve÷w = 3 x3÷w
アンプ (μg/g） = 2 x3×ve×499.19÷w = 1497.57×3÷W
ve: 抽出溶液の量i, 1.5mL; W: サンプル重量, g; 落とす: 499.19; 2: サンプル希釈係数.
- LiquidVolume:
アンプ (μmol/mL)＝2 x3×ve÷vs = 5×x3
アンプ (μg/ml
ve: 抽出溶液の量i, 1mL; 落とす: 499.19; VS： サンプルの量, 0.4mL； 2: サンプル希釈係数.
- 細胞量
アンプ (μmol/104セル)＝2 x3×ve÷n = 2×x3÷n
アンプ (μg/g104細胞）= 2 x3×ve×499.19÷n = 998.38×x3÷n
ve: 抽出溶液の量i, 1mL; 落とす: 499.19; N: セル数, 104 ユニットとして; 2: サンプル希釈係数.
注記:
予防:
- 検出後, クロマトグラフィーカラムは、高濃度のウルトラピア水で洗い流す必要があります (について 20-30 列ボリューム) クロマトグラフィーカラムの詰まりを防ぐため. ついに, クロマトグラフィックの損傷を防ぐために、列の仕様に従って列をフラッシュします
- 標準の希釈係数は、サンプル内のヌクレオチドの濃度に従って決定する必要があります. サンプル内のヌクレオチドのピーク領域は、異なる濃度の標準溶液のピーク領域内にある必要があります. 標準の希釈係数は参照のみです. サンプルのヌクレオチド濃度が高すぎる場合, 以前に希釈することをお勧めします
- 抽出後のサンプルは室温で安定していません, そのため、できるだけ早く操作する必要があります.
- サンプル番号が大きすぎる場合, 標準ソリューションを1日に1回テストすることをお勧めします (1つの標準ソリューションで十分です) 対応する保持を決定します
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