Solarbio ATP ADP AMP Contenuto Kit di test HPLC 50T | 48S

Nota: Prendi due o tre campioni diversi per la previsione prima del test. Attrezzatura operativa: Cromatografia liquida ad alte prestazioni Numero di catalogo: BC5114

Dimensioni：50T/48S

Componenti:

Soluzione di estrazione i: 80 ml×1. Archiviazione a 2-8 ℃.

Soluzione di estrazione II：40 ml×1. Archiviazione a 2-8 ℃.

Reagente I: 15 ml×1. Archiviazione a 2-8 ℃. Prima dell'uso, Prendere 3.5 ml di reagente I e aggiungilo a 1000 ml di acqua ultrapura, Regola il suo pH a 6.15 con reagente II per formare la fase mobile B, e sigillalo.

Reagente II:10 ml×1. Archiviazione a 2-8 ℃.

Standard ATP： Polvere×1. Conservazione a -20 ℃. Prima dell'uso, 1.8 Ml Acqua distillata viene aggiunta per prepararsi 1 μmol / ML Soluzione standard ATP, che è stato congelato a -20 °C. Per garantire l'integrità dell'ATP, Evita il congelamento e lo scongelamento ripetuti.

Standard ADP： Polvere×1. Conservazione a -20 ℃. Prima dell'uso, 2.34 Ml Acqua distillata viene aggiunta per prepararsi 1 μmol / ML Soluzione standard ATP, che è stato congelato a -20 °C. Per garantire l'integrità dell'ATP, Evita il congelamento e lo scongelamento ripetuti.

Standard AMP： Polvere×1. Conservazione a -20 ℃. Prima dell'uso, 2.0 Ml Acqua distillata viene aggiunta per prepararsi 1 μmol / ML Soluzione standard ATP, che è stato congelato a -20 °C. Per garantire l'integrità dell'ATP, Evita il congelamento e lo scongelamento ripetuti.

Descrizione del prodotto：

I nucleotidi hanno importanti funzioni biologiche. Sono una classe di composti composti da tre sostanze: base di purina o base di pirimidina, ribosio o deossiribosio, e acido fosforico. Sono principalmente coinvolti nella formazione di nucleosidi.

Adenosina trifosfato (ATP) è considerata una fonte di energia universale essenziale per la sintesi cellulare nella sopravvivenza e nella riproduzione di tutti gli organismi. L'ATP può essere prodotto attraverso una varietà di percorsi cellulari. L'esempio più tipico è la sintesi dell'adenosina trifosfato sintasi attraverso la fosforilazione ossidativa nei mitocondri, o sintesi per fotosintesi nei cloroplasti vegetali. Le principali fonti di energia per la sintesi di ATP sono gli acidi glucosio e grassi.

Adenosina difosfato (ADP) è ampiamente presente negli animali, impianti, Microrganismi, e cellule coltivate. Negli organismi, L'ADP è un prodotto per la rottura di un legame fosfato ad alta energia (ATP) idrolizzato per perdere un radicale fosfato) e rilasciare energia.

Adenosina monofosfato (Amp) è ampiamente presente negli animali, impianti, Microrganismi, e cellule coltivate. Si forma dopo l'energia di rilascio di ATP e ADP nel corpo. Può continuare a legare i gruppi di fosfato per formare adenosina difosfato (ADP) e adenosina trifosfato (ATP). È il prodotto dell'idrolisi incompleta di ATP.

ATP 、 ADP 、 L'amplificatore ha un picco di assorbimento a 254 nm, e il loro contenuto può essere determinato dalla cromatografia liquida ad alte prestazioni.

Reagenti e attrezzature necessari ma non forniti：

Cromatografo liquido ad alta efficienza (Colonna C18 (4.6× 250 mm), Rilevatore ultravioletto (VWD)), centrifuga da tavolo, pipetta regolabile, mortaio/omogeneizzatore, tubo EP marrone, 50 Filtri della siringa (acqua, 0.45

µm), siringa, filtro di aspirazione, membrana filtro (organico, acqua), 50 bottiglia di iniezione marrone (2 ml), acetonitrile (cromatograficamente puro, 500 ml), acqua ultrapura.

Preparativi prima dell'esperimento:

1. Utilizzo 500 ml di acetonitrile cromatograficamente puro (fase mobile A.) E 1000 ML di fase mobile B configurata da filtrare con una membrana del filtro per rimuovere le impurità nel solvente per evitare che intasare la colonna cromatografica. (Acetonitrile usa a 0.45 µm Membrana del filtro organico per filtrazione di aspirazione, e la fase mobile configurata B utilizza a 0.22 µm Membrana del filtro acquoso per filtrazione di aspirazione).
2. Ultrasuoni le fasi mobili preparate a e b per 30 minuti per rimuovere il gas nel solvente per evitare che intasare la colonna cromatografica e influenzano lo sperimentale
3. Preparazione di Standard ATP: 1 La soluzione standard ATP μmol/ml è diluita con acqua distillata a 0.5 µmol/ml, 0.1 µmol/ml, 0.05 µmol/ml, 0.01 µmol/ml, 0.005 Soluzione standard ATP μmol/ml. (La concentrazione standard preparata è solo a riferimento e può essere regolata in base alla concentrazione effettiva del campione). Lo standard viene filtrato usando un filtro a siringa acquoso nella bottiglia di iniezione marrone da testare (Si prega di posizionarlo a temperatura ambiente prima del test, in modo da non influire sul tempo di conservazione).
4. Preparazione di Standard ADP: 1 La soluzione standard ADP μmol/ml è diluita con acqua distillata a 0.5 µmol/ml, 0.1 µmol/ml, 0.05 µmol/ml, 0.01 µmol/ml, 0.005 Soluzione standard ADP μmol/ml. (La concentrazione standard preparata è solo a riferimento e può essere regolata in base alla concentrazione effettiva del campione). Lo standard viene filtrato usando un filtro a siringa acquoso nella bottiglia di iniezione marrone da testare (Si prega di posizionarlo a temperatura ambiente prima del test, in modo da non influire sul tempo di conservazione).
5. Preparazione di Standard AMP: 1 La soluzione standard AMP μmol/ml è diluita con acqua distillata a

0.5 µmol/ml, 0.1 µmol/ml, 0.05 µmol/ml, 0.01 µmol/ml, 0.005 Soluzione standard AMP μmol/ml. (La concentrazione standard preparata è solo a riferimento e può essere regolata in base alla concentrazione effettiva del campione). Lo standard viene filtrato usando un filtro a siringa acquoso nella bottiglia di iniezione marrone da testare (Si prega di posizionarlo a temperatura ambiente prima del test, in modo da non influire sul tempo di conservazione).

Procedura

1. preparazione del campione:

• • Campione di tessuto: Secondo il rapporto tra tessuto (G): Soluzione di estrazione i (ml) = 1:5~10 (Si consiglia di pesare 3 G campione di tessuto e aggiungi 1.5 ML Soluzione di estrazione i) Per aggiungere una soluzione di estrazione i, Omogenare sul ghiaccio, ed estrarre in un bagno di ghiaccio per 40 min. Centrifugare a 10000 giri al minuto per 10 Il mio a 4 ° C., Prendi 750 μl del surnatante, Aggiungi 750μl di estratto II, agitare bene (5 min) e mescolare bene, centrifugare nuovamente a 10000 RPM a 4 ° C per 10 min, e prendi il surnatante per filtrare con un filtro a siringa acquoso nella bottiglia di iniezione marrone da testare a temperatura ambiente (entro 2 H).
  • Campione cellulare: Secondo il rapporto di 10 milioni di cellule (unità): Soluzione di estrazione i (ml)= 1000 ~ 500:1 (Si consiglia di prendere 10 milioni di campioni di cellule e aggiungi 1 ML Soluzione di estrazione i) Aggiungi soluzione di estrazione i, cellule di rottura ad ultrasuoni sul ghiaccio (Potenza 300W, ultrasuoni per 3 secondi, intervallo di 7 secondi, tempo totale di 3 minuti); centrifuga a 4 ℃, 10000 giri al minuto per 10 minuti, Prendi 750 μl del surnatante, Aggiungi 750μl di estratto II, agitare bene (5 min) e mescolare bene, centrifugare nuovamente a 10000 RPM a 4 ° C per 10 min, e prendi il surnatante per filtrare con un filtro a siringa acquoso nella bottiglia di iniezione marrone da testare a temperatura ambiente (entro 2h).
  • Siero: Si consiglia di prendere 0.4 Ml Serum Sample, aggiungere 0.6 ML Soluzione di estrazione 1, ed estratto per 40 min in un bagno di ghiaccio. Centrifugare a 10000 giri al minuto per 10 Il mio a 4 ° C., Prendi 750 μl del surnatante, Aggiungi 750μl di estratto II, agitare bene (5 min) e mescolare bene, centrifugare nuovamente a 10000 RPM a 4 ° C per 10 min, e prendi il surnatante per filtrare con un filtro a siringa acquoso nella bottiglia di iniezione marrone da testare a temperatura ambiente (entro 2h).

2. Determinazione procedura：

1. Accendi il computer, Accendi i pulsanti dell'interruttore di ciascun modulo dell'HPLC, Installa la colonna cromatografica, Apri il software, e imposta il volume di iniezione nel gruppo Method su 10 µl, Temperatura della colonna: 27°C, portata 0.8 Ml/min, e lunghezza d'onda 254 nm, Il programma di eluizione è come mostrato nella tabella seguente, E il tempo di campionamento è 70 min. Dopo l'impostazione, Salva il gruppo Method.
2. Pulisci la colonna con la fase mobile, Equilibrare la colonna con un rapporto di fase mobile di acetonitrile: fase mobile b (ph = 6.15) = 2: 98, e iniziare l'iniezione dopo la linea di base è stabile.
3. Rileva la soluzione standard preparata, Il volume di iniezione è 10 µl, l'ATP, ADP, e l'amplificatore può essere separato all'interno 10 minuti, e il tempo di conservazione dell'ATP, ADP, E l'amplificatore parla 7.8 min, 6.7min e 5,4 minuti (il pH del sistema, colonna, fase mobile, eccetera. sono diversi, Il tempo di conservazione è diverso, Solo riferimento).
4. Rileva la soluzione campione preparata, Il volume di iniezione è 10 µl, e rilevare l'area di picco di ATP, ADP, e amplificatore alla ritenzione corrispondente

Tempo		Fase mobile
	UN		B
0 min	2%		98%
10 min	2%		98%
15 min	70%		30%
50 min	70%		30%
55 min	2%		98%
70 min	2%		98%

3. Calcoli：

1. Disegna curve standard di ATP, ADP, AMP con la concentrazione standard (µmol/ml) come X e l'area di picco come Y. Sostituire l'area di picco del campione nella curva standard per calcolare l'ATP, ADP, Concentrazione di AMP X1, x2, x3 (µmol/ml) nel

Contenuto ATP calcolo

1. Peso del campione

ATP (µmol/g)＝ 2 x1 × ve ÷ w = 3 x1 ÷ w

ATP (μg/g） = 2 x1 × ve × 551.14 ÷ w = 1653,42 x1 ÷ w

Ve: volume della soluzione di estratto i, 1.5ml; W: Peso del campione, G; Matp: 551.14; 2: Fattore di diluizione del campione.

1. Liquidvolume:

ATP (µmol/ml)＝ 2 x1 × ves = 5 × x1

ATP (μg/ml） = 2 x1 × ve × 551,14 ÷ vs = 2755,7 × x1

Ve: volume della soluzione di estratto i, 1ml; Matp: 551.14; VS： volume del campione, 0.4ml； 2: Fattore di diluizione del campione.

1. Quantità di celle

ATP (cella μmol/104)＝ 2 x1 × ve ÷ n = 2 × x1 ÷ n

ATP (cella μg/g104） = 2 x1 × ve × 551.14 ÷ n = 1102,28 × x1 ÷ n

Ve: volume della soluzione di estratto i, 1ml; Matp: 551.14; N: Numero di cellule, 104 come unità; 2: Fattore di diluizione del campione.

Contenuto ADP calcolo

1. Peso del campione

ADP (µmol/g)＝ 2 x2 × ve ÷ w = 3 x2 ÷ w

ADP (μg/g） = 2 x2 × ve × 427.2 ÷ w = 1281,6 x2 ÷ w

Ve: volume della soluzione di estratto i, 1.5ml; W: Peso del campione, G; Madp: 427.2; 2: Fattore di diluizione del campione.

1. Liquidvolume:

ADP (µmol/ml)＝ 2 x2 x ve ÷ vs = 5 x2

ADP (μg/ml） = 2 x2 × ve × 427.2 ÷ vs = 2136 × x2

Ve: volume della soluzione di estratto i, 1ml; Madp: 427.2; VS： volume del campione, 0.4ml； 2: Fattore di diluizione del campione.

1. Quantità di celle

ADP (cella μmol/104)＝ 2 x2 x ve ÷ n = 0,002 x2 ÷ n

ADP (cella μg/g104） = 2 x2 × ve × 427.2 ÷ n = 854,4 × x2 ÷ n

Ve: volume della soluzione di estratto i, 1ml; Madp: 427.2; N: Numero di cellule, 104 come unità; 2: Fattore di diluizione del campione.

Contenuto di amplificatore calcolo

1. Peso del campione

Amp (µmol/g)＝ 2 x3 × ve ÷ w = 3 x3 ÷ w

Amp (μg/g） = 2 x3 × ve × 499.19 ÷ w = 1497,57×3÷W

Ve: volume della soluzione di estratto i, 1.5ml; W: Peso del campione, G; Gocciolare: 499.19; 2: Fattore di diluizione del campione.

1. Liquidvolume:

Amp (µmol/ml)＝ 2 x3 × ve ÷ vs = 5 × x3

Amp (μg/ml） = 2 x3 × ve × 499.19 ÷ vs = 2495,95 × x3

Ve: volume della soluzione di estratto i, 1ml; Gocciolare: 499.19; VS： volume del campione, 0.4ml； 2: Fattore di diluizione del campione.

1. Quantità di celle

Amp (cella μmol/104)＝ 2 x3 × ve ÷ n = 2 × x3 ÷ n

Amp (cella μg/g104） = 2 x3 × ve × 499.19 ÷ n = 998,38 × x3 ÷ n

Ve: volume della soluzione di estratto i, 1ml; Gocciolare: 499.19; N: Numero di cellule, 104 come unità; 2: Fattore di diluizione del campione.

Nota:

Precauzioni:

1. Dopo il rilevamento, La colonna cromatografica deve essere scaricata con acqua ultrapura ad alta concentrazione (Di 20-30 volumi di colonne) Per evitare che intasare la colonna cromatografica. Finalmente, Lavare la colonna in base alle specifiche della colonna per prevenire danni al cromatografico
2. Il fattore di diluizione dello standard deve essere determinato in base alla concentrazione di nucleotidi nel campione. L'area di picco dei nucleotidi nel campione deve trovarsi all'interno dell'area di picco della soluzione standard di diverse concentrazioni. Il fattore di diluizione dello standard è solo un riferimento. Se la concentrazione di nucleotidi nel campione è troppo alta, Si consiglia di diluirlo prima
3. Il campione dopo l'estrazione non è stabile a temperatura ambiente, Quindi deve essere gestito il prima possibile.
4. Se il numero del campione è troppo grande, Si consiglia di testare la soluzione standard una volta al giorno (Una soluzione standard è sufficiente) Per determinare la conservazione corrispondente