1. Composants du kit de réactifs
| Caractéristiques | 50T | 100T |
| Chat. Non. | SN0237 | SN0238 |
| Colonnes d'extraction d'ADN (ensemble) | 50 (ensemble) | 100 (ensemble) |
| Tampon réactif E1 | 50ml | 2x50 ml |
| Tampon réactif E2 | 30ml | 2x30 ml |
| Tampon réactif B | 20ml | 2x20 ml |
| Tampon réactif C | 30 ml | 30 ml |
| Tampon de lavage 1 | 15 ml | 2 × 15 ml |
| Tampon d'élution | 20 ml | 20 ml |
| Protéinase K | 1ml | 1ml |
| RNase A | 1ml | 1ml |
| Manuel d'instructions | 1 | 1 |
2. Stockage
Ce kit peut être stocké à température ambiante (15-25℃) dans des conditions sèches pour 12 mois. Les colonnes de purification d'extraction d'ADN peuvent être stockées dans un environnement frais et sec pour 1 année. Protéinase K et RNase A contiennent des conservateurs, permettant le transport à température ambiante, mais pour un stockage à long terme, ils doivent être conservés à -20℃. Les tampons de réactifs E1 / E2 doivent être stockés à 4 ℃.
3. Instructions d'utilisation du kit de réactifs
3.1 Ce kit de réactifs est destiné à la recherche en biologie moléculaire et ne doit pas être utilisé pour le diagnostic ou le traitement de maladies..
3.2 Certains composants du kit de réactifs contiennent des irritants. Des mesures de protection telles que le port de vêtements et de lunettes de protection sont recommandées.
3.3 Pendant l'utilisation de ce kit de réactifs, une centrifugeuse à grande vitesse, bain d'eau (bain en métal), mélangeur de vortex, éthanol anhydre, PBS,eau déminéralisée stérile, et les tubes EP doivent être préparés par l'utilisateur.
4. Introduction au kit de réactifs
Le génome mitochondrial Purification de l'ADN Kit offre une méthode rapide et efficace pour purifier l'ADN des tissus animaux et des cultures cellulaires. Largement utilisé dans les tissus animaux et les cultures cellulaires, Ce kit se compose de deux parties. La première partie implique une collecte rapide de tissus animaux et de mitochondries de haute pureté en utilisant une centrifugation du gradient. La deuxième partie utilise une méthode basée sur une colonne pour l'extraction rapide de l'ADN mitochondrial sans avoir besoin de réactifs toxiques comme le phénol-chloroforme. L'ADN extrait peut être directement utilisé pour RAP, Southern Blot, et d'autres applications.
5. Principes et procédures expérimentaux
6. Processus d'extraction
Avant de commencer l'expérience:
UN. Tampons de réactifs B et C ont tendance à précipiter dans des conditions à basse température. Il est recommandé de les chauffer à 65 ° C pour 5 minutes jusqu'à ce que les précipités se dissolvent avant l'utilisation normale.
B. Avant d'utiliser Tampon de lavage 1, Suivez les instructions sur l'étiquette de la bouteille réactive pour ajouter la quantité spécifiée d'éthanol absolu. Alors, Vérifiez l'étiquette pour indiquer que l'éthanol a été ajouté.
C. Le tampon d'élution est un 0.1x solution TE avec un contenu EDTA minimal. Si l'EDTA affecte les expériences ultérieures, Il est suggéré d'utiliser de l'eau déionisée stérile au lieu du tampon d'élution.
D. Collection mitochondriale: La première partie consiste à collecter des mitochondries, où la centrifugation est cruciale. Pendant le processus d'extraction, La force centrifuge est exprimée en «G». La plupart des centrifuges ont un mode de conversion RPM / G, Alors s'il vous plaît faites attention.
- Traitement des échantillons:
UN. Prendre le milieu de la culture cellulaire, centrifuger à 1000g pour 1 minute pour collecter les cellules. Essayez de supprimer autant de surnageant que possible. Ajouter 1ML PBS (Ph7.9) Pour laver les cellules, centrifugeuse pour les récupérer, puis ajouter 1ML pré-refroidi (0℃) Tampon réactif E1 pour suspendre complètement les cellules et homogénéiser rapidement 5-10 fois.
B. Couper les tissus ne dépassant pas 200 mg en petits morceaux, ajouter 1ML PBS (Ph7.9) pour laver et absorber l'excès de liquide avec du papier filtre. Ajouter 1ML pré-refroidi (0℃) Tampon réactif E1 et broyer dans un bain de glace à propos 20 fois.
2. Transférer le mélange liquide dans un tube à centrifugeuse, centrifuger à 4℃, 1000g pour 5 minutes, et transférer le surnageant dans un nouveau tube à centrifugeuse.
(Note: Il peut y avoir des précipités dans ce surnageant transféré. Pour obtenir des mitochondries de haute pureté, il est recommandé de centrifuger et de transférer le surnageant pendant le pas 2.)
- Transférer le surnageant obtenu à l'étape précédente vers un nouveau tube à centrifugeuse, centrifugeuse à 12000g, 4℃ pour 10 minutes, et jeter le surnageant.
(Note: Après cette étape, Les mitochondries se précipiteront au bas du tube.)
- Étape recommandée: Ajouter 5ML réactif tampon E2 à la pastille mitochondriale, remettre en suspension, centrifuger à 4℃, 1000g pour 5 minutes, Transférer le surnageant dans un nouveau tube à centrifugeuse, puis centrifuger à 12000g, 4℃ pour 10 minutes, jeter le surnageant, et obtenir des précipités mitochondriaux de haute pureté au fond du tube.
(Note: La collection de mitochondries à cette étape est terminée. Vous pouvez interrompre l'expérience et stocker les mitochondries à -70℃.)
Deuxième partie: Isolement et purification de l'ADN mitochondrial
- Ajouter 280μl de tampon réactif b, 10µl de RNase A, et 10 μl de protéinase k au tube à centrifugeur contenant des mitochondries. Inversé complètement pour mélanger, digérer 65℃ pour 5 minutes.
- Ajouter 300μl de tampon réactif C au lysat et bien mélanger. Si un précipité blanc apparaît, il peut être laissé sans être perturbé; sa disparition n'affectera pas les expériences ultérieures.
- Ajouter 300µl d'éthanol absolu et mélanger soigneusement. Cela peut provoquer des précipitations, Mais cela n'affectera pas les expériences ultérieures.
- Transférer le liquide obtenu dans la colonne de purification d'extraction d'ADN (ensemble) (environ 650 ~ 700 μl à chaque fois). Centrifuger à plus de 8,000 tr/min pour 1 minute, jeter les déchets collectés, et réinsérez le tube de collecte dans la colonne de purification pour l'étape suivante.
- Placer la colonne de purification d'extraction d'ADN (ensemble) dans un tube de collecte, ajouter 300µl de tampon de lavage 1, centrifuger à plus de 8,000 tr/min pour 1 minute, jeter les déchets, et réinsérer la colonne de purification d'extraction d'ADN (ensemble) dans le tube pour la prochaine étape.
(Note: Confirmez que de l'éthanol absolu a été ajouté au tampon de lavage. 1.)
- Ajouter 400µl de tampon de lavage 1 à la colonne de purification d'extraction d'ADN (ensemble), centrifuger à 14,000 tr/min (20,000×g) pour 2 minutes. Prolonger le temps de centrifugation de manière appropriée pour une membrane plus sèche.
- Placer la colonne de purification d'extraction d'ADN (ensemble) Dans un nouveau tube à centrifugeuse, Ouvrez le capuchon, et incuber à 65℃ pour 2 minutes. Étendre cette étape au besoin pour évaporer complètement de l'éthanol pour empêcher l'éthanol résiduel de affecter les expériences en aval.
- Suspension à la suspension 50-100µl de tampon d'élution sur la membrane, centrifuger à 12,000 tr/min pour 2 minutes.
(Note: 1. L'ADN éluant avec 50 μl de tampon d'élution peut augmenter la concentration de l'ADN mais réduire le rendement total; 2. Le lavage d'ADN élué peut être réappliqué à la colonne de purification d'extraction d'ADN pour une collection supplémentaire à 12,000 tr/min pour 2 minutes pour augmenter le rendement de l'ADN.)
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