Mitochondriales Genom -DNA -Extraktionskit (Für Tiere)

1. Bestandteile des Reagenzienkits

2. Lagerung

Dieses Kit kann bei Raumtemperatur gelagert werden (15-25℃) unter trockenen Bedingungen für 12 Monate. Die DNA -Extraktionsreinigungssäulen können in einer kühlen und trockenen Umgebung gespeichert werden 1 Jahr. Proteinase K und RNase A enthalten Konservierungsstoffe, ermöglicht den Transport bei Raumtemperatur, aber zur Langzeitlagerung, Sie sollten bei -20℃ aufbewahrt werden. Reagenzpuffer E1/E2 sollten bei 4 ℃ gelagert werden.

3. Anweisungen zur Verwendung des Reagenzienkits

3.1 Dieses Reagenzienkit ist für die molekularbiologische Forschung bestimmt und sollte nicht zur Diagnose oder Behandlung von Krankheiten verwendet werden.

3.2 Einige Komponenten im Reagenzienkit enthalten Reizstoffe. Schutzmaßnahmen wie das Tragen von Schutzkleidung und Schutzbrille werden empfohlen.

3.3 Während der Verwendung dieses Reagenzienkits, eine Hochgeschwindigkeitszentrifuge, Wasserbad (Metallbad), Vortexmixer, Wasserfreies Ethanol, PBS,steriles entionisiertes Wasser, und EP-Röhren müssen vom Benutzer vorbereitet werden.

4. Einführung in das Reagenzienkit

Das mitochondriale Genom DNA-Reinigung Kit bietet eine schnelle und effiziente Methode zur Reinigung von DNA aus tierischen Geweben und Zellkulturen. Sowohl in Tiergewebe als auch in Zellkulturen häufig verwendet, Dieses Kit besteht aus zwei Teilen. Der erste Teil beinhaltet eine schnelle Sammlung von Tiergewebe- und Zell-Mitochondrien mit hoher Purity unter Verwendung von Gradientenzentrifugation. Der zweite Teil verwendet eine säulenbasierte Methode zur schnellen Extraktion der mitochondrialen DNA, ohne dass giftige Reagenzien wie Phenolchloroform erforderlich sind. Die extrahierte DNA kann direkt verwendet werden PCR, Southern Blot, und andere Anwendungen.

5. Experimentelle Prinzipien und Verfahren

6. Extraktionsprozess

Vor Beginn des Experiments:

A. Reagenzpuffer B und C. neigen dazu, unter Bedingungen mit niedriger Temperatur auszurüsten. Es wird empfohlen, sie bei 65 ° C zu erhitzen 5 Minuten, bis sich die Niederschläge vor dem normalen Gebrauch auflösen,.

B. Vor der Verwendung Waschpuffer 1, Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Label Reagent Bottle, um die angegebene Menge an absolutem Ethanol hinzuzufügen. Dann, Überprüfen Sie das Etikett, um anzuzeigen, dass Ethanol hinzugefügt wurde.

C. Elutionspuffer ist ein 0.1x TE-Lösung mit minimalem EDTA -Inhalt. Wenn EDTA nachfolgende Experimente beeinflusst, Es wird empfohlen, steriles entionisiertes Wasser anstelle des Elutionspuffers zu verwenden.

D. Mitochondriensammlung: Der erste Teil besteht darin, Mitochondrien zu sammeln, wo die Zentrifugation von entscheidender Bedeutung ist. Während des Extraktionsprozesses, Die Zentrifugalkraft wird in ausgedrückt ‚G‘. Die meisten Zentrifugen haben einen Drehzahl/G -Konvertierungsmodus, Also bitte achten Sie auf.

1. Probenverarbeitung:

A. Zellkulturmedium nehmen, Zentrifuge bei 1000 g für 1 Minute, um Zellen zu sammeln. Versuchen Sie, so viel Überstand wie möglich zu entfernen. Hinzufügen 1ML PBS (Ph7.9) die Zellen waschen, Zentrifuge, um sie zu sammeln, dann hinzufügen 1ML vorgekühlt (0℃) Reagenzpuffer E1 die Zellen vollständig auszusetzen und schnell homogenisieren 5-10 mal.

B. Gewebe abschneiden, die nicht überschritten werden 200 mg in kleine Stücke, hinzufügen 1ML PBS (Ph7.9) zum Waschen und Absorptieren von überschüssiger Flüssigkeit mit Filterpapier. Hinzufügen 1ML vorgekühlt (0℃) Reagenzpuffer E1 und in einem Eisbad herum mahlen 20 mal.

2. Übertragen Sie das flüssige Gemisch in ein Zentrifugenröhrchen, Zentrifuge bei 4℃, 1000G für 5 Protokoll, und übertragen Sie den Überstand in eine neue Zentrifugenröhre.

(Notiz: In diesem übertragenen Überstand kann es ausfällt. Zur Erlangung von Mitochondrien mit hoher Purity, Es wird empfohlen, den Überstand während des Schritts zu zentrifizieren und zu übertragen 2.)

3. Übertragen Sie den im vorherigen Schritt erhaltenen Überstand in eine neue Zentrifugenröhre, Zentrifuge bei 12000g, 4℃ für 10 Protokoll, und den Überstand verwerfen.

(Notiz: Nach diesem Schritt, Mitochondrien fällt am Boden des Rohrs aus.)

4. Empfohlener Schritt: Hinzufügen 5ML Reagenzpuffer E2 zum Mitochondrienpellet, Stellen Sie es resuspendieren, Zentrifuge bei 4℃, 1000G für 5 Protokoll, Übertragen Sie den Überstand in eine neue Zentrifugenröhre, dann zentrifugieren bei 12000g, 4℃ für 10 Protokoll, Den Überstand verwerfen, und mitochondriale Niederschläge am Rohrboden erhalten.

(Notiz: Die Mitochondriensammlung in diesem Schritt ist abgeschlossen. Sie können das Experiment unterbrechen und Mitochondrien speichern -70℃.)

Zweiter Teil: Isolierung und Reinigung von mitochondrialer DNA

5. Hinzufügen 280μl Reagenzpuffer B, 10μl RNase A, und 10 μl Proteinase K. zum Zentrifugenröhrchen, der Mitochondrien enthält. Gründlich invertieren, um zu mischen, verdauen bei 65℃ für 5 Protokoll.
6. Hinzufügen 300μl Reagenzpuffer C. zum Lysat und gut mischen. Wenn ein weißer Niederschlag erscheint, Es kann ungestört bleiben; Das Verschwinden wird nachfolgenden Experimenten nicht beeinflussen.
7. Hinzufügen 300μl von absolutem Ethanol und gründlich mischen. Es kann Niederschlag verursachen, Es wird sich jedoch nicht auf die nachfolgenden Experimente auswirken.
8. Übertragen Sie die erhaltene Flüssigkeit in die DNA -Extraktionsreinigungssäule (Satz) (jedes Mal ungefähr 650 ~ 700 μl). Zentrifuge um mehr als 8,000 U/min für 1 Minute, Entsorgen Sie den gesammelten Abfall, und setzen Sie das Sammelröhrchen für den nächsten Schritt wieder in die Reinigungssäule ein.
9. Platzieren Sie die DNA-Extraktions-Reinigungssäule (Satz) in ein Sammelrohr, hinzufügen 300μl Waschpuffer 1, Zentrifuge um mehr als 8,000 U/min für 1 Minute, Entsorgen Sie den Abfall, und die DNA-Extraktionsreinigungssäule erneut investieren (Satz) in die Röhre für den nächsten Schritt.

(Notiz: Bestätigen Sie, dass das absolute Ethanol hinzugefügt wurde, um den Puffer zu waschen 1.)

10. Hinzufügen 400μl Waschpuffer 1 zur DNA-Extraktions-Reinigungssäule (Satz), Zentrifuge bei 14,000 U/min (20,000×g) für 2 Protokoll. Die Zentrifugationszeit für eine trockenere Membran angemessen verlängern.
11. Platzieren Sie die DNA-Extraktions-Reinigungssäule (Satz) in einer neuen Zentrifugenröhre, Öffne die Kappe, und inkubieren bei 65℃ für 2 Protokoll. Erweitern Sie diesen Schritt nach Bedarf, um Ethanol vollständig zu verdampfen, um zu verhindern.
12. Tropf-Suspend 50-100μl Elutionspuffer auf die Membran, Zentrifuge bei 12,000 U/min für 2 Protokoll.

(Notiz: 1. Eluting DNA mit 50 μl Elutionspuffer kann die DNA -Konzentration erhöhen, aber die Gesamtausbeute verringern; 2. Die eluierte DNA -Wäsche kann für eine zusätzliche Sammlung bei der DNA -Extraktionsreinigungssäule erneut angewendet werden 12,000 U/min für 2 Minuten, um die DNA -Ertrag zu erhöhen.)