1. 試劑盒的組成
| 規格 | 50時間 | 100時間 |
| 貓. 不. | SN0237 | SN0238 |
| DNA萃取柱 (放) | 50 (放) | 100 (放) |
| 試劑緩衝液 E1 | 50毫升 | 2x50毫升 |
| 試劑緩衝液 E2 | 30毫升 | 2x30毫升 |
| 試劑緩衝液B | 20毫升 | 2x20毫升 |
| 試劑緩衝液C | 30 毫升 | 30 毫升 |
| 洗滌緩衝液 1 | 15 毫升 | 2 × 15 毫升 |
| 洗脫緩衝液 | 20 毫升 | 20 毫升 |
| 蛋白酶K | 1毫升 | 1毫升 |
| 核糖核酸酶A | 1毫升 | 1毫升 |
| 使用說明書 | 1 | 1 |
2. 貯存
此套件可在室溫下保存 (15-25℃) 在乾燥條件下 12 月. DNA提取純化柱可以儲存在陰涼乾燥的環境中 1 年. 蛋白酶 K 和 核糖核酸酶A 含防腐劑, 允許在室溫下運輸, 但為了長期儲存, 應保存在-20℃. 試劑緩衝液E1/E2應在4℃保存.
3. 試劑盒使用說明
3.1 本試劑盒適用於分子生物學研究，不得用於疾病診斷或治療.
3.2 試劑盒中部分成分含有刺激物. 建議採取防護措施，例如穿著防護衣和護目鏡.
3.3 本試劑盒使用過程中, 高速離心機, 水浴 (金屬浴), 渦旋混合器, 無水乙醇, 公共廣播公司,無菌去離子水, 和EP管需用戶自備.
4. 試劑盒簡介
粒線體基因組 DNA純化 試劑盒提供了一種快速有效的從動物組織和細胞培養物中純化 DNA 的方法. 廣泛用於動物組織和細胞培養, 該套件由兩個部分組成. 第一部分涉及使用梯度離心快速收集高純度動物組織和細胞粒線體. 第二部分利用以柱為基礎的方法快速萃取粒線體 DNA，無需使用苯酚-氯仿等有毒試劑. 萃取的DNA可直接用於 聚合酶鍊式反應, 南方印跡, 和其他應用.
5. 實驗原理和程序
6. 提取過程
開始實驗前:
A. 試劑緩衝液 B 和 C 低溫條件下容易沉澱. 建議在 65°C 下加熱 5 分鐘直至沉澱物溶解後再正常使用.
乙. 使用前 洗滌緩衝液 1, 依照試劑瓶標籤說明添加指定量的無水乙醇. 然後, 檢查標籤顯示已添加乙醇.
C. 洗脫緩衝液是 0.1x TE 解決方案 EDTA 含量極低. EDTA是否影響後續實驗, 建議使用無菌去離子水代替洗脫緩衝液.
D. 粒線體集合: 第一部分涉及收集粒線體, 離心至關重要的地方. 在提取過程中, 離心力以“g”表示. 大多數離心機都有 rpm/g 轉換模式, 所以請注意.
- 樣品加工:
A. 取細胞培養基, 1000g 離心 1 分鐘收集細胞. 盡量去除盡可能多的上清液. 添加 1毫升PBS (PH7.9) 洗滌細胞, 離心機收集它們, 然後加 1毫升預冷 (0℃) 試劑緩衝液 E1 充分懸浮細胞並快速勻漿 5-10 次.
乙. 切割組織不超過 200 毫克切成小塊, 添加 1毫升PBS (PH7.9) 用於洗滌並用濾紙吸收多餘液體. 添加 1毫升預冷 (0℃) 試劑緩衝液 E1 並在冰浴中研磨約 20 次.
2. 將液體混合物轉移至離心管中, 離心機在 4℃, 1000克為 5 分分鐘, 並將上清液轉移至新的離心管中.
(筆記: 轉移的上清液中可能有沉澱. 用於獲得高純度粒線體, 建議在步驟過程中離心並轉移上清液 2.)
- 將上一步所得的上清液轉移至新的離心管中, 12000g 離心機, 4℃ 為了 10 分分鐘, 並丟棄上清液.
(筆記: 這一步之後, 粒線體會沉澱在管底部.)
- 推薦步驟: 添加 5ml 試劑緩衝液 E2 到粒線體沉澱, 重新暫停它, 離心機在 4℃, 1000克為 5 分分鐘, 將上清液轉移至新的離心管中, 然後12000g離心, 4℃ 為了 10 分分鐘, 棄去上清液, 並在管底獲得高純度粒線體沉澱.
(筆記: 至此粒線體收集完成. 您可以中斷實驗並將粒線體儲存在 -70℃.)
第二部分: 粒線體 DNA 的分離與純化
- 添加 280µl 試劑緩衝液 B, 10µl RNase A, 和 10μl 蛋白酶 K 至含有粒線體的離心管. 徹底翻轉混合, 消化於 65℃ 為了 5 分分鐘.
- 添加 300µl 試劑緩衝液 C 加入裂解液並充分混合. 如果出現白色沉澱, 它可以不受干擾; 它的消失不會影響後續實驗.
- 添加 300μl 無水乙醇 並充分混合. 可能會導致降水, 但不影響後續實驗.
- 將所得液體轉移至DNA萃取純化柱中 (放) (每次約650~700μl). 離心機在超過 8,000 轉速為 1 分分鐘, 丟棄收集的廢棄物, 並將收集管重新插入純化管柱進行下一步.
- 放置DNA萃取純化管柱 (放) 進入收集管, 添加 300µl 洗滌緩衝液 1, 離心機轉速超過 8,000 轉速為 1 分分鐘, 丟棄廢棄物, 並重新插入DNA萃取純化管柱 (放) 進入管中進行下一步.
(筆記: 確認洗滌緩衝液中已添加無水乙醇 1.)
- 添加 400µl 洗滌緩衝液 1 至DNA萃取純化管柱 (放), 離心機在 14,000 轉速 (20,000×g) 為了 2 分分鐘. 對於較乾燥的膜適當延長離心時間.
- 放置DNA萃取純化管柱 (放) 在新的離心管中, 打開蓋子, 並孵化於 65℃ 為了 2 分分鐘. 根據需要延長此步驟，使乙醇完全蒸發，防止殘留乙醇影響下游實驗.
- 滴懸 50-100µl 洗脫緩衝液 到膜上, 離心機在 12,000 轉速為 2 分分鐘.
(筆記: 1. 用50μl Elution Buffer洗脫DNA可以增加DNA濃度，但會降低總產量; 2. 洗脫的 DNA 洗滌液可重新應用於 DNA 萃取純化柱，以便在以下時間進行額外收集： 12,000 轉速為 2 分鐘提高 DNA 產量.)
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