Solarbio超氧化物歧化酶 (草皮) 活性測定試劑盒

超氧化物歧化酶 (草皮) 活性測定試劑盒

筆記: 有必要預測 2-3 正式測定前差異較大的樣品.

操作設備: 分光光度計

目錄號: BC0170

尺寸: 50T/24S

成分:

萃取試劑: 60 毫升×1. 4℃保存.

試劑Ⅰ: 15 毫升×1. 4℃保存.

試劑Ⅱ: 160 微升×1. 4℃保存. 離心後用移液管吹打混合勻.

試劑Ⅲ: 11 毫升×1. 4℃保存.

試劑IV: 粉末×1. 4℃保存.

試劑V: 2 毫升×1. 4℃保存. 使用前將試劑IV加入試劑V中，以振盪器充分搖勻. 可以保存 3 月.

產品描述:

超氧化物歧化酶 (草皮, 歐共體 1.15.1.1) 廣泛存在於動物體內, 植物, 微生物和培養細胞. 它催化超氧陰離子形成H2O2和O2. SOD不僅是超氧陰離子清除酶, 也是主要的 H2O2 產生酶, 在生物抗氧化系統中扮演重要角色.

超氧陰離子 (氧氣-) 由黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶反應系統產生. 氧氣- 可以還原藍色四唑生成藍色甲臢, 其吸光度為 560 奈米. SOD可以去除O2- 並抑制蛋氨酸的形成. 反應液的藍色越深, SOD活性越低. 反應液的藍色越淺, SOD活性越高.

需要但未提供的試劑和設備:

分光光度計, 桌上型離心機, 移液管, 1 毫升玻璃比色皿, 研缽/均質器, 冰和蒸餾水.

操作步驟:

我. 樣品製備:

1. 細菌或細胞: 將細菌或細胞收集到離心管中, 離心後棄去上清液. 根據細菌或細胞的比例 (104 細胞): 萃取液體積 (毫升) 的 1:5-10 提取. 建議 5 1mL萃取試劑中百萬個細菌或細胞量. 用超音波破碎細菌或細胞 (置於冰上, 超音波功率200W或 20%, 工作時間3秒, 間隔10秒, 重複 30 次). 離心機在 8000 ×g 為 10 4℃分鐘去除不溶物, 並在測試前將上清液放在冰上.
2. 組織: 根據組織重量比例 (G): 萃取液體積 (毫升) 的 1:5-10 提取. 建議 0.1 g 組織 1 mL 萃取試劑並在冰上完全均質.
3. 離心機在, 8000 ×g 為 10 4℃分鐘去除不溶物, 並在測試前將上清液放在冰上.
4. 血清 (電漿) 樣本: 直接檢測樣品.

二. 決心 程式:

1. 預熱分光光度計 30 分分鐘, 調整波長至 560 nm 並用蒸餾水調零.
2. 保留試劑Ⅰ, 試劑Ⅲ, 試劑V在水浴中放置超過 5 37℃ 分鐘(哺乳動物) 或者

25℃ (其他物種).

3. 加入如下清單的試劑:

試劑 (微升)	試管 (時間)	控制管 (C)	空白管 (B1)	空白管 (B2)
樣本	90	90	–	–
試劑Ⅰ	240	240	240	240
試劑Ⅱ	6	–	6	–
試劑Ⅲ	180	180	180	180
蒸餾水	480	486	570	576
試劑V	30	30	30	30

充分混合並將混合物在室溫下孵育 30 分分鐘. 將混合物加入 1mL 玻璃比色皿中, 並檢測各管的吸光度值 560 奈米. ΔAT=AT-AC，ΔAB=AB1-AB2. 如果底部有降水, 充分混合，然後測量.

三、. 計算:

1. 抑制百分比:

抑制百分比=[ΔAB-ΔAT]÷ΔAB× 100%

抑制率應在30%~70% (值接近 50% 會有更準確的結果). 如果計算出的抑制百分比小於 30% 或超過 70%, 通常需要調整樣品添加量並重新確定. 如果抑制百分比太高, 樣品應適當稀釋. 如果抑制百分比太低, 應重新製備更高濃度的樣品.

2. 單位定義: 1個酵素活力單位定義為催化抑製作用的酵素量 50% 上述黃嘌呤的反應系統中
3. 計算

A. 血清 (電漿)樣本

草皮 (單位/毫升)=[P÷(1-磷)×Vrv]÷Vs×F=11.4×P÷(1-磷)×F

乙. 組織, 細菌或培養細胞

A) 蛋白質濃度:

草皮 (U/mL 蛋白質) = [P÷(1-磷)×Vrv]÷(Vs×Cpr)×F=11.4×P÷(1-磷)÷Cpr×F

乙) 樣品重量

草皮 (單位/克重量) = [P÷(1-磷)×Vrv]÷(W×Vs÷Vsv)×F=11.4×P÷(1-磷)÷寬×長

C) 細菌或細胞數量

草皮 (U/104細胞)=[P÷(1-磷)×Vrv]÷(500×Vs÷Vsv)×F=0.0228×P÷(1-磷)×F

繩索: 總反應體積, 1.026 毫升; VS: 樣品量, 0.09 毫升;

電壓: 萃取量, 1 毫升;

心肺復甦: 樣品蛋白濃度, 毫克/毫升; 瓦: 樣品重量, G;

500: 細菌和細胞總數, 5 百萬. 磷: 抑制百分比, %;

F: 樣品稀釋倍數.

筆記:

1. 樣品和試劑Ⅱ應置於冰上
2. 當樣本較多時, 工作解決方案 (包括試劑 I, 二、三) 可依表格進行配置. 必須添加試劑 V
3. 反應完成後, 可能會形成沉澱, 之後可以確定

實驗實例:

1. 1 g 稗子加入 1 用於均質的萃取試劑毫升數. 取上清液後, 請依照確定步驟進行操作. 結果顯示：ΔAT=AT – 交流電= 0.335-0.012 = 0.323, ΔAB = AB1 – AB2 = 0.957-0.003 = 0.954. 抑制百分比= (ΔAB- ΔAT)÷ ΔAB × 100% = 72%, 根據樣品質量計算酵素活力.

SOD活性 (U/克質量) = 11.4 × 抑制百分比 (1-抑制百分比) × W = 293.14 U/克質量.

2. 1 加入 mL 萃取試劑 0.1 g 大鼠脾臟用於均質化. 取上清液後, 請依照確定步驟進行操作. 結果顯示：ΔAT=AT- 交流電= 0.563-0.213 = 0.35, ΔAB=AB1- AB2= 0.957-0.003 = 0.954, 抑制率= (ΔAB-ΔAT)÷ ΔAB×100% =31%

SOD活性 (U/克質量) = 11.4 × 抑制百分比 (1-抑制百分比) ×W = 196.71 U/克質量.

3. 10 提取並離心 100 萬個細胞，加入 1 萃取試劑毫升數, 然後再依照判斷步驟進行操作. 結果如下: ΔAT =AT – AC=614-0.015 = 0.599, ΔAB=AB1- AB2= 0.944-0.005 = 0.939, 抑制率= (ΔAB- ΔAT) ×ΔAB× 100% = 36.21%

SOD活性 (U/104細胞) = 抑制百分比 ÷ (1-抑制百分比)× 車輛運輸系統]÷(1000× VS ÷ VTS) = 0.0065 U/104細胞.

參考:

• 斯皮茲D R, 奧伯利LW. 哺乳類組織勻漿中超氧化物歧化酶活性的測定[J]. 分析生物化學, 1989,179(1):8-18.
• 中正康, 浩志. 一種臨床上用超氧化物歧化酶活性的簡化測定方法[J]. 臨床化學學報, 1979,92(3):337-342.

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