Solarbio Superóxido Dismutasa (CÉSPED) Kit de ensayo de actividad

Superóxido dismutasa (CÉSPED) Kit de ensayo de actividad

Nota: Es necesario predecir 2-3 muestras de gran diferencia antes de la determinación formal.

Equipo de operación: espectrofotómetro

No gato: BC0170

Tamaño: 50T/24S

Componentes:

reactivo de extracción: 60 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Reactivo ⅰ: 15 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Reactivo ⅱ: 160 µL×1. Almacenamiento a 4 ℃. Mezclar por pipeteo después de la centrifugación.

Reactivo Ⅲ: 11 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Reactivo ⅳ: Polvo × 1. Almacenamiento a 4 ℃.

Reactivo V: 2 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃. Agregue el reactivo ⅳ al reactivo V antes de usar y agite con un oscilador para mezclar completamente. Se puede almacenar 3 meses.

Descripción del Producto:

Superóxido dismutasa (CÉSPED, CE 1.15.1.1) se encuentra ampliamente en animales, plantas, microorganismos y células cultivadas. Cataliza el anión superóxido para formar H2O2 y O2. SOD no es solo la enzima eliminante del anión superóxido, pero también la enzima productor de H2O2 principal, que juega un papel importante en el sistema antioxidante biológico.

Anión superóxido (O2-) se produce por el sistema de reacción de xantina y xantina oxidasa. O2- puede reducir el tetrazol azul para crear formazan azul, que tiene absorbancia en 560 Nuevo Méjico. Sod puede eliminar O2- e inhibir la formación de metionina. Cuanto más oscuro es el color azul de la solución de reacción, cuanto menor es la actividad de SOD. Cuanto más claro es el color azul de la solución de reacción, Cuanto mayor sea la actividad de SOD.

Reactivos y equipos necesarios pero no suministrados:

espectrofotómetro, centrífuga de mesa, pipeta de transferencia, 1 cubeta de vidrio de ml, mortero/homogeneizador, hielo y agua destilada.

Pasos de operación:

I. preparación de la muestra:

1. Bacterias o células: recolectando bacterias o células en el tubo de centrífuga, Deseche el sobrenadante después de la centrifugación. De acuerdo con la proporción de bacterias o células (104 células): volumen de solución de extracción (mililitros) de 1:5-10 extraer. Se sugiere que 5 Millones de bacterias o células cantidad con 1 ml de reactivo de extracción. Dividir las bacterias o las células con ultrasonicación (colocado sobre hielo, potencia ultrasónica 200W o 20%, Tiempo de trabajo 3s, intervalo 10s, repetir para 30 veces). Centrifugar en 8000 ×g para 10 minutos a 4 ℃ para eliminar materiales insolubles, y tomar el sobrenadante en hielo antes de realizar la prueba..
2. Tejido: Según la proporción de peso del tejido (gramo): volumen de solución de extracción (mililitros) de 1:5-10 extraer. Se sugiere que 0.1 g de tejido con 1 ml de reactivo de extracción y completamente homogeneizado en hielo.
3. Centrifugar en, 8000 ×g para 10 minutos a 4 ℃ para eliminar materiales insolubles, y tomar el sobrenadante en hielo antes de realizar la prueba..
4. Suero (plasma) muestra: detectar la muestra directamente.

II. Determinación procedimiento:

1. Precalentar el espectrofotómetro durante 30 minutos, ajustar la longitud de onda a 560 nm y set cero con agua destilada.
2. Mantenga reactivo ⅰ, Reactivo Ⅲ, Reactivo V en baño de agua por más de 5 minutos a 37 ℃(mamífero) o

25℃ (otras especies).

3. Agregue reactivos con la siguiente lista:

Reactivo (µL)	Tubo de ensayo (t)	tubo de control (C)	tubo en blanco (B1)	tubo en blanco (B2)
Muestra	90	90	–	–
Reactivo ⅰ	240	240	240	240
Reactivo ⅱ	6	–	6	–
Reactivo Ⅲ	180	180	180	180
Agua destilada	480	486	570	576
Reactivo V	30	30	30	30

Mezclar bien y la mezcla se incuba a temperatura ambiente para 30 minutos. Agregue la mezcla en una cubeta de vidrio de 1 ml, y detectar el valor de absorbancia de cada tubo en 560 Nuevo Méjico. Δat = AT-AC，ΔAb = AB1-AB2. Si hay precipitación en la parte inferior, mezclar bien y luego medir.

III. Cálculo:

1. Porcentaje de inhibición:

Porcentaje de inhibición =[Δab -Δat]÷ Δab × 100%

El porcentaje de inhibición debe estar en 30%~ 70% (el valor cercano a 50% tendrá un resultado más preciso). Si el porcentaje de inhibición calculado es menor que 30% o más de 70%, Por lo general, es necesario ajustar la cantidad de adición de la muestra y volver a determinar. Si el porcentaje de inhibición es demasiado alto, la muestra debe diluirse adecuadamente. Si el porcentaje de inhibición es demasiado bajo, la muestra debe volver a prepararse con una concentración más alta..

2. Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza la inhibición de 50% En el sistema de reacción de la xantina anterior
3. Cálculo

A. Suero (plasma)muestra

CÉSPED (unidades/mL)=[P ÷(1-PAG)× VRV]÷ vs × f = 11.4 × p ÷(1-PAG)× F

B. Tejido, bacterias o células cultivadas

a) Concentración de proteínas:

CÉSPED (U/ml prot) = [P ÷(1-PAG)× VRV]÷(Vs×Cpr)× F = 11.4 × P ÷(1-PAG)÷ CPR × F

b) Peso de la muestra

CÉSPED (Peso U/g) = [P ÷(1-PAG)× VRV]÷(W×Vs÷Vsv)× F = 11.4 × P ÷(1-PAG)÷ W × F

C) Bacteria o cantidad de células

CÉSPED (celda U/104)=[P ÷(1-PAG)× VRV]÷(500×Vs÷Vsv)× F = 0.0228 × P ÷(1-PAG)× F

Soga: Volumen total de reacción, 1.026 mililitros; contra: Volumen de la muestra, 0.09 mililitros;

vsv: Volumen de extracción, 1 mililitros;

RCP: Concentración de proteína de muestra, mg/mL; W.: Peso de la muestra, gramo;

500: Número total de bacterias y células., 5 millón. PAG: Porcentaje de inhibición, %;

F: Dilución de muestra múltiple.

Nota:

1. La muestra y el reactivo ⅱ deben colocarse en hielo cuando
2. Cuando hay muchas muestras, la solución de trabajo (incluyendo el reactivo I, II y III) se puede configurar de acuerdo con la tabla. Reactivo V debe agregarse
3. Después de que se completara la reacción, Puede haber precipitación formada, que se puede determinar después

Ejemplos experimentales:

1. 1 G de Echinochloa Crusgalli se agrega a 1 ml de reactivo de extracción para la homogeneización. Después de que se tome el sobrenadante, La operación se lleva a cabo de acuerdo con los pasos de determinación. Los resultados mostraron que Δat = AT – AC = 0.335-0.012 = 0.323, ΔAb = AB1 - AB2 = 0.957-0.003 = 0.954. Porcentaje de inhibición = (ΔAB- Δat)÷ Δab × 100% = 72%, y la actividad enzimática se calcula de acuerdo con la masa de la muestra.

Actividad de SOD (masa U/g) = 11.4 × Porcentaje de inhibición (1-Porcentaje de inhibición) × W = 293.14 masa U/g.

2. 1 ml de reactivo de extracción se agrega a 0.1 G del bazo de rata para la homogeneización. Después de que se tome el sobrenadante, La operación se lleva a cabo de acuerdo con los pasos de determinación. Los resultados mostraron que Δat = AT- AC = 0.563-0.213 = 0.35, ΔAb = AB1- AB2 = 0.957-0.003 = 0.954, Porcentaje de inhibición = (Δab -Δat)÷ ΔAb × 100% = 31%

Actividad de SOD (masa U/g) = 11.4 × Porcentaje de inhibición (1-Porcentaje de inhibición) × W = 196.71 masa U/g.

3. 10 millones de células se extraen y se centrifugan agregando 1 mL de reactivo de extracción, y luego la operación se realiza de acuerdo con los pasos de determinación. Los resultados son los siguientes: Δat = AT – AC = 614-0.015 = 0.599, ΔAb = AB1- AB2 = 0.944-0.005 = 0.939, Porcentaje de inhibición = (ΔAB- Δat) × Δab × 100% = 36.21%

Actividad de SOD (celda U/104) = Porcentaje de inhibición ÷ (1-Porcentaje de inhibición)× VTS]÷(1000× vs ÷ VTS) = 0.0065 celda U/104.

Referencias:

• Spitz D.R., Oberley L W. Un ensayo para la actividad de superóxido dismutasa en homogeneizados de tejido de mamíferos[j]. Bioquímica analítica, 1989,179(1):8-18.
• Masayasu M, Hiroshi Y.. Un método de ensayo simplificado de la actividad de la superóxido dismutasa para uso clínico.[j]. Clínica de Acta Chemical, 1979,92(3):337-342.

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