โซลาร์ไบโอ ซูเปอร์ออกไซด์ ดิสมิวเตส (เอสโอดี) ชุดทดสอบกิจกรรม

ซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส (เอสโอดี) ชุดทดสอบกิจกรรม

บันทึก: มีความจำเป็นต้องคาดการณ์ 2-3 ตัวอย่างที่แตกต่างกันมากก่อนการพิจารณาอย่างเป็นทางการ.

อุปกรณ์การดำเนินงาน: สเปกโตรโฟโตมิเตอร์

หมายเลขแมว: BC0170

ขนาด: 50ที/24ส

ส่วนประกอบ:

รีเอเจนต์การสกัด: 60 มล.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.

รีเอเจนต์ Ⅰ: 15 มล.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.

รีเอเจนต์ Ⅱ: 160 ไมโครลิตร×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃. ผสมโดยการปิเปตหลังจากการปั่นแยก.

รีเอเจนต์ Ⅲ: 11 มล.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.

รีเอเจนต์ Ⅳ: ผง×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.

รีเอเจนต์ V: 2 มล.×1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃. เติมรีเอเจนต์ Ⅳ ลงในรีเอเจนต์ V ก่อนใช้งาน และเขย่าด้วยออสซิลเลเตอร์เพื่อผสมให้เข้ากัน. ก็สามารถเก็บไว้ได้ 3 เดือน.

รายละเอียดสินค้า:

ซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส (เอสโอดี, อีซี 1.15.1.1) พบมากในสัตว์, พืช, จุลินทรีย์และเซลล์เพาะเลี้ยง. มันเร่งปฏิกิริยาไอออนซูเปอร์ออกไซด์ให้กลายเป็น H2O2 และ O2. SOD ไม่ได้เป็นเพียงเอนไซม์กำจัดไอออนซูเปอร์ออกไซด์เท่านั้น, แต่ยังเป็นเอนไซม์หลักที่สร้าง H2O2 ด้วย, ซึ่งมีบทบาทสำคัญในระบบต้านอนุมูลอิสระทางชีวภาพ.

ซูเปอร์ออกไซด์ไอออน (O2-) ผลิตโดยระบบปฏิกิริยาแซนไทน์และแซนไทน์ออกซิเดส. O2- สามารถลดเททราโซลสีน้ำเงินเพื่อสร้างฟอร์มาซานสีน้ำเงินได้, ซึ่งมีการดูดซึมเข้าไป 560 นาโนเมตร. SOD สามารถกำจัด O2 ได้- และยับยั้งการสร้างเมไทโอนีน. ยิ่งสีน้ำเงินเข้มของสารละลายปฏิกิริยา, ยิ่งกิจกรรมของ SOD ต่ำลง. ยิ่งสีฟ้าอ่อนของสารละลายปฏิกิริยา, ยิ่งกิจกรรมของ SOD สูงเท่าไร.

รีเอเจนต์และอุปกรณ์ที่จำเป็นแต่ไม่ได้จัดเตรียมไว้ให้:

สเปกโตรโฟโตมิเตอร์, เครื่องหมุนเหวี่ยงแบบตั้งโต๊ะ, ปิเปตโอน, 1 คิวเวตต์แก้วขนาดมล, ปูน/โฮโมจีไนเซอร์, น้ำแข็งและน้ำกลั่น.

ขั้นตอนการดำเนินงาน:

ฉัน. การจัดเตรียมตัวอย่าง:

1. แบคทีเรียหรือเซลล์: รวบรวมแบคทีเรียหรือเซลล์เข้าไปในหลอดหมุนเหวี่ยง, ทิ้งส่วนเหนือตะกอนหลังจากการปั่นแยก. ตามสัดส่วนของแบคทีเรียหรือเซลล์ (104 เซลล์): ปริมาณสารละลายสกัด (มล) ของ 1:5-10 เพื่อสกัด. ก็มีข้อเสนอแนะว่า 5 จำนวนแบคทีเรียหรือเซลล์นับล้านด้วยรีเอเจนต์การสกัด 1 มล. การแยกแบคทีเรียหรือเซลล์ด้วยอัลตราโซนิก (วางบนน้ำแข็ง, กำลังอัลตราโซนิค 200W หรือ 20%, เวลาทำงาน 3 วินาที, ช่วงเวลา 10 วินาที, ทำซ้ำเพื่อ 30 ครั้ง). เครื่องปั่นแยกที่ 8000 ×กรัม สำหรับ 10 นาทีที่ 4 ℃ เพื่อขจัดวัสดุที่ไม่ละลายน้ำ, และนำส่วนเหนือตะกอนไปบนน้ำแข็งก่อนทำการทดสอบ.
2. เนื้อเยื่อ: ตามสัดส่วนของน้ำหนักเนื้อเยื่อ (ก): ปริมาณสารละลายสกัด (มล) ของ 1:5-10 เพื่อสกัด. ก็มีข้อเสนอแนะว่า 0.1 กรัมของเนื้อเยื่อด้วย 1 รีเอเจนต์สำหรับการสกัด มล. และถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันโดยสมบูรณ์บนน้ำแข็ง.
3. เครื่องปั่นแยกที่, 8000 ×กรัม สำหรับ 10 นาทีที่ 4 ℃ เพื่อขจัดวัสดุที่ไม่ละลายน้ำ, และนำส่วนเหนือตะกอนไปบนน้ำแข็งก่อนทำการทดสอบ.
4. เซรั่ม (พลาสมา) ตัวอย่าง: ตรวจจับตัวอย่างได้โดยตรง.

ครั้งที่สอง. การกำหนด ขั้นตอน:

1. เปิดเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ก่อน 30 นาที, ปรับความยาวคลื่นเป็น 560 nm และตั้งค่าศูนย์ด้วยน้ำกลั่น.
2. เก็บรีเอเจนต์ Ⅰ, รีเอเจนต์ Ⅲ, รีเอเจนต์ V ในอ่างน้ำนานกว่า 5 นาทีที่ 37 ℃(สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม) หรือ

25℃ (สายพันธุ์อื่น).

3. เพิ่มรีเอเจนต์ตามรายการต่อไปนี้:

รีเอเจนต์ (ไมโครลิตร)	หลอดทดลอง (ต)	หลอดควบคุม (ค)	หลอดเปล่า (B1)	หลอดเปล่า (บี2)
ตัวอย่าง	90	90	–	–
รีเอเจนต์ Ⅰ	240	240	240	240
รีเอเจนต์ Ⅱ	6	–	6	–
รีเอเจนต์ Ⅲ	180	180	180	180
น้ำกลั่น	480	486	570	576
รีเอเจนต์ V	30	30	30	30

ผสมให้เข้ากันและบ่มส่วนผสมไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลาหนึ่ง 30 นาที. เติมส่วนผสมลงในคิวเวตต์แก้วขนาด 1 มล, และตรวจค่าการดูดกลืนแสงของแต่ละหลอดได้ที่ 560 นาโนเมตร. ∆AT=AT-AC，∆AB=AB1-AB2. หากมีฝนตกบริเวณด้านล่าง, ผสมให้เข้ากันแล้วตวง.

สาม. การคำนวณ:

1. เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง:

เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง=[∆AB -∆AT]∆AB× 100%

เปอร์เซ็นต์การยับยั้งควรอยู่ที่ 30% ~ 70% (มูลค่าที่ใกล้เคียง 50% จะได้ผลลัพธ์ที่แม่นยำยิ่งขึ้น). หากเปอร์เซ็นต์การยับยั้งที่คำนวณได้น้อยกว่า 30% หรือมากกว่านั้น 70%, โดยปกติจำเป็นต้องปรับปริมาณการเติมตัวอย่างและพิจารณาอีกครั้ง. หากเปอร์เซ็นต์การยับยั้งสูงเกินไป, ควรเจือจางตัวอย่างอย่างเหมาะสม. หากเปอร์เซ็นต์การยับยั้งต่ำเกินไป, ควรเตรียมตัวอย่างด้วยความเข้มข้นที่สูงขึ้น.

2. คำจำกัดความของหน่วย: กิจกรรมของเอนไซม์หนึ่งหน่วยหมายถึงปริมาณของเอนไซม์ที่กระตุ้นการยับยั้ง 50% ในระบบปฏิกิริยาของแซนทีนข้างต้น
3. การคำนวณ

ก. เซรั่ม (พลาสมา)ตัวอย่าง

เอสโอดี (ยู/มล)-[พี۞(1-ป)×วีอาร์วี]۞Vs×F=11.4×P۞(1-ป)×ฟ

บี. เนื้อเยื่อ, แบคทีเรียหรือเซลล์เพาะเลี้ยง

ก) ความเข้มข้นของโปรตีน:

เอสโอดี (U/มล. โปรต) - [พี۞(1-ป)×วีอาร์วี]÷(เทียบกับ×ซีพีอาร์)×F=11.4×P÷(1-ป)۞ซีพีอาร์×ฟ

ข) น้ำหนักตัวอย่าง

เอสโอดี (น้ำหนักยู/กรัม) - [พี۞(1-ป)×วีอาร์วี]÷(W × Vs ۞ Vsv)×F=11.4×P÷(1-ป)۞W×F

ค) จำนวนแบคทีเรียหรือเซลล์

เอสโอดี (เซลล์ U/104)-[พี۞(1-ป)×วีอาร์วี]÷(500×Vs۞Vsv)×F=0.0228×P÷(1-ป)×ฟ

เชือก: ปริมาตรปฏิกิริยาทั้งหมด, 1.026 มล; เทียบกับ: ปริมาณตัวอย่าง, 0.09 มล;

เทียบกับ: ปริมาณการสกัด, 1 มล;

ซีพีอาร์: ตัวอย่างความเข้มข้นของโปรตีน, มก./มล; ว: น้ำหนักตัวอย่าง, ก;

500: จำนวนแบคทีเรียและเซลล์ทั้งหมด, 5 ล้าน. ป: เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง, %;

เอฟ: ตัวอย่างการเจือจางทวีคูณ.

บันทึก:

1. ควรวางตัวอย่างและรีเอเจนต์ Ⅱ บนน้ำแข็งเมื่อใด
2. เมื่อมีตัวอย่างมากมาย, วิธีแก้ปัญหาการทำงาน (รวมถึงรีเอเจนต์ I, II และ III) สามารถกำหนดค่าได้ตามตาราง. ต้องเพิ่มรีเอเจนต์ V
3. หลังจากปฏิกิริยาเสร็จสิ้น, อาจมีฝนตกเกิดขึ้น, ซึ่งสามารถกำหนดได้ภายหลัง

ตัวอย่างการทดลอง:

1. 1 g ของ Echinochloa crusgalli ลงไป 1 มิลลิลิตรของรีเอเจนต์การสกัดสำหรับการทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน. หลังจากนำส่วนเหนือตะกอนออกไปแล้ว, การดำเนินการจะดำเนินการตามขั้นตอนการกำหนด. ผลการทดลองพบว่า ∆AT = AT – เอซี = 0.335-0.012 - 0.323, ∆AB = AB1 – AB2 = 0.957-0.003 - 0.954. เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง = (∆AB- ∆AT)÷ ∆AB × 100% - 72%, และกิจกรรมของเอนไซม์คำนวณตามมวลตัวอย่าง.

กิจกรรมเอสโอดี (มวลยู/กรัม) - 11.4 × เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง (1-เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง) × ว = 293.14 มวลยู/กรัม.

2. 1 เติมมิลลิลิตรของรีเอเจนต์การสกัดลงไป 0.1 กรัมของม้ามหนูเพื่อทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน. หลังจากนำส่วนเหนือตะกอนออกไปแล้ว, การดำเนินการจะดำเนินการตามขั้นตอนการกำหนด. ผลการทดลองพบว่า ∆AT= AT- เอซี = 0.563-0.213 - 0.35, ∆AB= AB1- AB2= 0.957-0.003 - 0.954, เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง = (∆AB -∆AT)÷ ∆AB×100% =31%

กิจกรรมเอสโอดี (มวลยู/กรัม) - 11.4 × เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง (1-เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง) ×W = 196.71 มวลยู/กรัม.

3. 10 ล้านเซลล์ถูกสกัดและปั่นแยกโดยการเพิ่ม 1 มิลลิลิตรของรีเอเจนต์การสกัด, จากนั้นดำเนินการตามขั้นตอนการกำหนด. ผลลัพธ์มีดังนี้: ∆AT =AT – เอซี=614-0.015 = 0.599, ∆AB= AB1- AB2= 0.944-0.005 - 0.939, เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง = (∆AB- ∆AT) ×∆AB× 100% - 36.21%

กิจกรรมเอสโอดี (เซลล์ U/104) = เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง ۞ (1-เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง)× วีทีเอส]÷(1000× VS ۞VTS) - 0.0065 เซลล์ U/104.

อ้างอิง:

• สปิตซ์ ดี.อาร์, โอเบอร์ลีย์ แอล ดับเบิลยู. การทดสอบฤทธิ์ของซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตสในเนื้อเยื่อที่เป็นเนื้อเดียวกันของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม[เจ]. ชีวเคมีวิเคราะห์, 1989,179(1):8-18.
• มาซายาสุ เอ็ม, ฮิโรชิ วาย. วิธีตรวจวิเคราะห์กิจกรรมซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตสแบบง่ายสำหรับการใช้งานทางคลินิก[เจ]. Clinica Chimica แอคต้า, 1979,92(3):337-342.

สินค้าที่เกี่ยวข้อง:

BC0190/BC0195 โพลีฟีนอลออกซิเดส (ป.ป.ช) ชุดทดสอบกิจกรรม

BC0210/BC0215 ฟีนิลอัลนีนแอมโมเนียไลเอส (เพื่อน) ชุดทดสอบกิจกรรม

BC0200/BC0205 คาตาเลส (แมว) ชุดทดสอบกิจกรรม

BC0090/BC0095 เพอรอกซิเดส (พ็อด) ชุดทดสอบกิจกรรม