ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (พีซีอาร์) ได้ปฏิวัติการวิจัยและวินิจฉัยอณูชีววิทยา. เทคนิคอเนกประสงค์นี้ช่วยให้สามารถขยายลำดับดีเอ็นเอเป้าหมายแบบเอ็กซ์โปเนนเชียลได้ภายในเวลาเพียงไม่กี่ชั่วโมง. แต่คุณจะรู้ได้อย่างไรว่า PCR ของคุณใช้งานได้? และถ้าคุณสร้างผลิตภัณฑ์ที่คาดหวัง, คุณจะกำหนดขนาดที่แม่นยำของมันได้อย่างไร? นี่คือจุดที่บันได DNA เข้ามา.
บันไดดีเอ็นเอคืออะไร?
บันไดดีเอ็นเอประกอบด้วยชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่รู้จัก, ขนาดเฉพาะ. เช่นเดียวกับไม้บรรทัดที่มีเครื่องหมายเป็นนิ้วหรือเซนติเมตร, บันได DNA ทำหน้าที่เป็นข้อมูลอ้างอิงขนาดเมื่อใช้เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส. โดยการเปรียบเทียบแถบตัวอย่าง PCR ของคุณกับชิ้นส่วนแลดเดอร์, คุณสามารถประมาณขนาดของชิ้นส่วน DNA ที่ไม่รู้จักของคุณได้.
บันไดดีเอ็นเอประกอบด้วยโมเลกุลดีเอ็นเอตั้งแต่ 100 คู่ฐานไปมากกว่า 10,000 คู่ฐาน. แฟรกเมนต์มักจะเป็นทวีคูณของ 100 หรือ 1,000 คู่ฐาน. บันไดที่มีช่วงเวลาของ 100 bp เหมาะที่สุดสำหรับการกำหนดขนาดของผลิตภัณฑ์ PCR ขนาดเล็ก, ในขณะที่ 1 บันได kb ทำงานได้ดีกว่าสำหรับแอมพลิฟายเออร์ขนาดใหญ่.
DNA Ladder ถูกสร้างขึ้นมาอย่างไร?
ในขณะที่สามารถซื้อบันไดสำเร็จรูปได้, คุณสามารถสร้างบันได DNA ของคุณได้ในห้องทดลอง. ต่อไปนี้เป็นวิธีการเตรียมทั่วไปบางประการ:
- การจำกัดการย่อยของเอนไซม์ พลาสมิดดีเอ็นเอ– พลาสมิดถูกตัดด้วยเอนไซม์ เช่น HindIII หรือ EcoRI เพื่อปลดปล่อยชิ้นส่วนที่มีขนาดเฉพาะ.
- การขยายเสียงโดย PCR– ลำดับเป้าหมายที่มีความยาวต่างกันจะถูกขยายทีละรายการ จากนั้นจึงรวมเข้าด้วยกันเป็นบันได.
- การย่อยบางส่วนของ concatamers– การทำซ้ำลำดับดีเอ็นเอซ้ำกันจะถูกแยกออกเพื่อสร้างมัลติเมอร์.
- การผสมพันธุ์โอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์– ชิ้นส่วนดีเอ็นเอสายเดี่ยวสั้น ๆ จะถูกหลอมให้เป็นมัลติเมอร์แบบเกลียวคู่.
ไม่ว่าวิธีการผลิตจะเป็นอย่างไร, สิ่งสำคัญคือการสร้างชุดแถบแยกซึ่งครอบคลุมช่วงขนาดที่ต้องการ.
DNA Ladder ใช้อย่างไร?
ตอนนี้คุณคงเข้าใจแล้วว่าบันได DNA คืออะไร, มันใช้ยังไง? บันได DNA มีจุดประสงค์สำคัญสองประการ:
1. การประมาณขนาด
ด้วยการเดินบันได DNA ควบคู่ไปกับตัวอย่าง PCR ของคุณบนเจลอะกาโรสหรือโพลีอะคริลาไมด์, คุณสามารถประมาณขนาดของชิ้นส่วน DNA ที่ไม่รู้จักของคุณได้.
ระหว่างอิเล็กโทรโฟรีซิส, แลดเดอร์และตัวอย่างจะเคลื่อนที่ผ่านเจลเมทริกซ์ในอัตราที่ขึ้นอยู่กับขนาดของพวกมัน. เศษเล็กเศษน้อยเดินทางไกลลงไปตามเจล, ในขณะที่ชิ้นส่วนขนาดใหญ่จะล่าช้า.
เมื่อ DNA ถูกย้อมและมองเห็นได้, เศษบันไดปรากฏคมกริบ, วงดนตรีที่ไม่ต่อเนื่อง. โดยจัดเรียงแถบตัวอย่างของคุณด้วยแถบบันไดที่มีขนาดตรงกัน, คุณสามารถกำหนดความยาวโดยประมาณของผลิตภัณฑ์ PCR ของคุณได้.
2. ควบคุมคุณภาพ
การรวมบันได DNA ยังทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมการมองเห็นว่าการขยาย PCR ของคุณทำงานอย่างไร. เมื่อคุณสังเกตเห็นแถบตัวอย่างที่แตกต่างกันซึ่งย้ายไปยังตำแหน่งที่คาดหวังซึ่งสัมพันธ์กับบันได, นี่เป็นการยืนยันอย่างรวดเร็วว่า PCR ของคุณสำเร็จ.
หากคุณไม่ได้ดูวงดนตรีใด ๆ, บันไดบ่งชี้ว่าอิเล็กโทรโฟรีซิสนั้นดำเนินการอย่างเหมาะสม. สิ่งนี้บ่งชี้ว่าปฏิกิริยา PCR ของคุณอาจล้มเหลวและจำเป็นต้องแก้ไขปัญหา.
ฉันควรใช้บันได DNA ขนาดใด?
ด้วยบันได DNA ที่หลากหลาย, คุณจะเลือกอันที่เหมาะสมสำหรับการทดสอบของคุณได้อย่างไร? นี่คือปัจจัยสำคัญที่ต้องพิจารณา:
- ช่วงขนาด– กลุ่มผลิตภัณฑ์แลดเดอร์ต้องครอบคลุมขนาดผลิตภัณฑ์ PCR ที่คุณคาดหวัง. สำหรับแอมพลิฟายเออร์ด้านล่าง 1 กิโลไบต์, ก 100 บีพีหรือ 1 บันได kb เหมาะสม. สำหรับผลิตภัณฑ์ขนาดใหญ่, เลือกบันไดที่สูงขึ้นเช่น 5 กิโลไบต์หรือ 10 กิโลไบต์.
- ระยะห่างของวงดนตรี– บันไดที่มีแถบอ้างอิงมากกว่าในช่วงขนาดที่กำหนดช่วยให้กำหนดขนาดได้แม่นยำยิ่งขึ้น. อย่างไรก็ตาม, แถบที่มีระยะห่างกันมากจะใช้เวลานานกว่าในการแก้ไขอย่างสมบูรณ์. หากเวลามีจำกัดหรือต้องการเพียงขนาดโดยประมาณเท่านั้น, ใช้บันไดที่มีชิ้นส่วนน้อยลง.
- พร้อมโหลด– พรีเมด, บันไดที่พร้อมบรรจุรับประกันความเข้มของแถบที่แม่นยำ. หลีกเลี่ยงการเจือจางหรือผสมบันไดด้วยตัวเอง.
- หมายเลขตัวอย่าง– สำหรับตัวอย่างหลายรายการ, เลือกขนาดเลนบันไดที่ใหญ่ขึ้นเพื่อให้สามารถเปรียบเทียบแบบเคียงข้างกันได้.
- งบประมาณ – พิจารณาต้นทุนหากผลิตเจลในปริมาณมาก. บันไดบางอันประหยัดกว่า.
ฉันจะอ่านบันได DNA ได้อย่างไร?
เมื่อมองเห็นเจลของคุณหลังจากอิเล็กโทรโฟรีซิส, คุณจะอ่านบันไดเพื่อกำหนดขนาดผลิตภัณฑ์ PCR ได้อย่างไร? ทำตามขั้นตอนเหล่านี้:
- ระบุช่องทางที่มีชิ้นส่วนบันได DNA. โดยทั่วไปจะโหลดในเลนแรกและ/หรือเลนสุดท้าย.
- สังเกตขนาดของแถบ DNA คู่ฐานตามแผนภูมิอ้างอิงของผู้ผลิตบันได. บันไดมีรหัสสีเพื่อให้อ่านง่าย.
- เปรียบเทียบแถบตัวอย่างที่ไม่รู้จักของคุณกับบันได, ระบุแถบที่ใกล้ที่สุดในเลนบันได. ขนาดของสายรัดของคุณใกล้เคียงกับส่วนของบันไดนั้น.
- เพื่อความแม่นยำยิ่งขึ้น, สอดแทรกขนาดวงดนตรีระหว่างชิ้นส่วนบันไดสองชิ้น. ตัวอย่างเช่น, หากวงดนตรีของคุณวิ่งอยู่ระหว่าง 500 และ 600 วงบันได bp, ประมาณขนาดของมันเป็น 550 บีพี.
- เพื่อเพิ่มความแม่นยำในการปรับขนาด, วิ่งเจลให้นานขึ้นเพื่อเพิ่มการแยกระหว่างแถบบันได. การโหลดบันไดในปริมาณที่น้อยลงยังช่วยปรับปรุงความละเอียดของแบนด์ได้อีกด้วย.
ตัวอย่างบันได DNA ที่ใช้กันทั่วไปมีอะไรบ้าง?
บันได DNA หลายประเภทมีจำหน่ายจากผู้ผลิต เช่น New England Biolabs, เทอร์โมฟิชเชอร์, และอินไวโตรเจน. ตัวเลือกที่ใช้กันทั่วไปได้แก่:
- 100 bp DNA บันได – ประกอบด้วย 12 เศษจาก 100 bp ถึง 1,500 บีพี. เหมาะสำหรับผลิตภัณฑ์ PCR ภายใต้ 1,000 บีพี.
- 1 kb บันไดดีเอ็นเอ– ประกอบด้วย 13 วงดนตรีจาก 250 bp ถึง 10,000 บีพี. เหมาะอย่างยิ่งสำหรับแอมพลิฟายเออร์จนถึง 10 กิโลไบต์.
- 1 kb Plus DNA แลดเดอร์– เวอร์ชันขยายของ 1 บันได kb พร้อมชิ้นส่วนน้ำหนักโมเลกุลสูงและต่ำเพิ่มเติม.
- บันไดดีเอ็นเอ FastDigest– บันไดที่ผ่านการย่อยสลายพร้อมสำหรับการโหลดลงบนเจลโดยตรง. แบนด์น้อยลงทำให้มีเวลาทำงานที่รวดเร็ว.
- บันไดดีเอ็นเอน้ำหนักโมเลกุลสูง – ประกอบด้วยชิ้นส่วน DNA ที่ใหญ่กว่าถึง 48,500 bp สำหรับการปรับขนาด DNA จีโนมที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูง.
ฉันจะเตรียมและบรรจุบันได DNA ได้อย่างไร?
เพื่อใช้ประโยชน์จากบันได DNA ของคุณอย่างเต็มที่, เทคนิคการเตรียมและการบรรจุที่เหมาะสมเป็นสิ่งสำคัญ:
- ตรวจสอบความสมบูรณ์ของบันไดก่อนใช้งาน – ตรวจสอบว่ามีรอยเปื้อนหรือการเสื่อมสภาพของวงดนตรีหรือไม่.
- ผสมเบา ๆ – หลีกเลี่ยงการหมุนวนอย่างรุนแรงเพื่อป้องกันการตัด DNA.
- ใช้ปริมาณที่ผู้ผลิตแนะนำ – การบรรทุกน้อยเกินไปทำให้ความเข้มของแถบความถี่อ่อน. การบรรทุกมากเกินไปทำให้เกิดความอิ่มตัว.
- บรรทุกบันไดในเลนแรกและ/หรือเลนสุดท้าย – ให้การอ้างอิงขนาดทั้งสองด้านของตัวอย่างของคุณ.
- รวมเลนที่ไม่มีบันได – ทำหน้าที่ควบคุมการปนเปื้อน.
การปฏิบัติตามแนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุดเหล่านี้จะทำให้คุณได้รับประสิทธิภาพแลดเดอร์ที่เหมาะสมที่สุดทุกครั้ง.
ฉันจะสร้างบันได DNA ของฉันได้อย่างไร?
ในขณะที่การซื้อบันไดสำเร็จรูปเป็นเส้นทางที่ง่ายที่สุด, คุณสามารถสร้างบันได DNA ของคุณโดยใช้ PCR และการย่อยแบบจำกัดได้. นี่คือภาพรวมของกระบวนการ:
- ออกแบบไพรเมอร์ PCR เพื่อขยายลำดับเป้าหมายเฉพาะที่มีความยาวต่างกัน, เช่น 500, 750, 1,000, และ 1,500 บีพี.
- เรียกใช้ PCR แต่ละรายการโดยใช้ไพรเมอร์คู่แต่ละคู่เพื่อสร้างชิ้นส่วน DNA ตามขนาดที่กำหนด.
- ทำให้ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์และวัดปริมาณความเข้มข้นของ DNA สำหรับแต่ละชิ้นส่วน.
- ย่อยชิ้นส่วนด้วยเอนไซม์จำกัดเดียวกันเพื่อสร้างปลายที่เหนียวเข้ากันได้.
- ผสมชิ้นส่วนในอัตราส่วนโมลเฉพาะเพื่อให้ได้ความเข้มของแถบสีที่ต้องการ.
- เชื่อมชิ้นส่วนเข้าด้วยกันเพื่อสร้างมัลติเมอร์แยกจากกันตามไซต์จำกัด.
- ขยายโดยใช้ไพรเมอร์สากลเพื่อสร้างคอนคาทาเมอร์.
- ย่อยคอนคาทาเมอร์บางส่วนด้วยเอนไซม์จำกัดเดิมเพื่อตัดที่ไซต์ภายใน.
- ทำให้บริสุทธิ์และผสมสารที่ย่อยลงในบันได DNA สุดท้ายของคุณ.
เหตุใดบันได DNA จึงมีความสำคัญสำหรับ PCR?
บันได DNA จำเป็นสำหรับปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (พีซีอาร์) การสมัครด้วยเหตุผลสำคัญหลายประการ:
ความแม่นยำและความสามารถในการทำซ้ำ
แลดเดอร์ DNA ช่วยให้สามารถกำหนดขนาดได้อย่างแม่นยำและทำซ้ำผลลัพธ์ PCR ได้สม่ำเสมอ. โดยการเปรียบเทียบสายรัดของคุณกับมาตรฐานน้ำหนักโมเลกุลของบันได, คุณสามารถกำหนดขนาดแอมพลิฟายเออร์ได้อย่างแม่นยำและยืนยันการขยายเป้าหมายที่ประสบความสำเร็จ. ซึ่งช่วยให้สามารถทำซ้ำผลลัพธ์ได้อย่างน่าเชื่อถือกับผู้ใช้หลายราย, อุปกรณ์, และห้องปฏิบัติการ.
การทำให้เป็นมาตรฐาน
การรวมลำดับขั้น DNA จะทำให้การเปรียบเทียบระหว่างตัวอย่าง PCR หลายตัวอย่างเป็นมาตรฐาน. ไม่ว่าคุณกำลังวิเคราะห์สภาวะที่แตกต่างกันของตัวอย่างเดียวหรือคัดกรองตัวอย่างของผู้ป่วยจำนวนมาก, บันไดให้ข้อมูลอ้างอิงอย่างต่อเนื่องเพื่อประเมินผลลัพธ์. การกำหนดมาตรฐานมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อความสม่ำเสมอในการวิจัยและการวินิจฉัยทางคลินิก.
การเพิ่มประสิทธิภาพ
บันไดช่วยอำนวยความสะดวกในการปรับ PCR ให้เหมาะสมโดยระบุว่ามีการขยายตามที่คาดไว้หรือไม่. ขนาดสายรัดที่ไม่คาดคิดหรือความเข้มที่น้อยเผยให้เห็นสภาวะที่ต่ำกว่าปกติ. แลดเดอร์ช่วยในการแก้ไขปัญหาโปรโตคอลเพื่อให้ได้ไพรเมอร์ที่ดีที่สุด, สภาพการปั่นจักรยาน, และความบริสุทธิ์ของตัวอย่าง.
ความไว
ด้วยบันไดช่วงกว้าง, แม้แต่แถบ PCR ที่จางก็สามารถมองเห็นและปรับขนาดได้. ซึ่งช่วยให้สามารถตรวจจับสำเนาเทมเพลตที่มีปริมาณน้อยซึ่งสำคัญสำหรับแอปพลิเคชัน เช่น การตรวจสอบปริมาณไวรัส. ความไวที่ได้จากแลดเดอร์รองรับการใช้ PCR ในการตรวจจับโมเลกุลเดี่ยว.
มัลติเพล็กซ์
สำหรับมัลติเพล็กซ์ PCR ที่มีชุดไพรเมอร์หลายชุด, บันไดตรวจสอบตัวตนของแต่ละวงเป้าหมาย. ซึ่งช่วยให้สามารถขยายลำดับหลายลำดับได้อย่างมีประสิทธิภาพในปฏิกิริยาเดียว.
ระบบอัตโนมัติ
แลดเดอร์ DNA ช่วยให้สามารถวิเคราะห์ซอฟต์แวร์ของเจล PCR ได้โดยอัตโนมัติ. อัลกอริธึมของคอมพิวเตอร์อาศัยบันไดเพื่อทำให้ความแตกต่างในการย้ายแบนด์ระหว่างเจลเป็นปกติ. ทำให้มีปริมาณงานสูง, การวิเคราะห์จำนวนตัวอย่างจำนวนมากอย่างรวดเร็ว.
ในระยะสั้น, บันได DNA ช่วยให้ PCR มีความแม่นยำ, การทำซ้ำ, การทำให้เป็นมาตรฐาน, การเพิ่มประสิทธิภาพ, ความไว, ความสามารถในการมัลติเพล็กซ์, และระบบอัตโนมัติ. ไม่ว่าคุณกำลังปรับปรุงเกณฑ์วิธีใหม่ให้สมบูรณ์แบบหรือวิเคราะห์ตัวอย่างทางคลินิก, เครื่องมือสำคัญนี้จะขยายความสำเร็จของคุณและสนับสนุนผลการวิจัยที่ยอดเยี่ยม.
