Was ist eine DNA -Leiter? Was macht die DNA -Leiter in PCR??

Polymerasekettenreaktion (PCR) hat die molekulare Biologieforschung und -diagnostik revolutioniert. Diese vielseitige Technik ermöglicht die exponentielle Amplifikation von Ziel -DNA -Sequenzen in wenigen Stunden. Aber woher wissen Sie, ob Ihre PCR funktioniert hat?? Und wenn Sie das erwartete Produkt generiert haben, Wie können Sie die genaue Größe bestimmen?? Hier kommen DNA -Leitern herein.

Was ist eine DNA -Leiter?

Eine DNA -Leiter enthält DNA -Fragmente von Bekannten, Spezifische Größen. Genau wie ein Herrscher mit Markierungen in Zoll oder Zentimetern, Eine DNA -Leiter fungiert als Größenreferenz beim Ausführen von Gelelektrophorese. Durch Vergleich Ihrer PCR -Beispielbänder mit den Leiterfragmenten, Sie können die Größe Ihrer unbekannten DNA -Fragmente schätzen.

DNA -Leitern bestehen aus DNA -Molekülen, die von 100 Basispaare bis über 10,000 Basispaare. Die Fragmente sind oft mehrfach von 100 oder 1,000 Basispaare. Leitern mit Intervallen von 100 BP eignet sich am besten zur Bestimmung der Größe kleiner PCR -Produkte, während 1 KB -Leitern funktionieren besser für größere Amplikons.

Wie wird eine DNA -Leiter hergestellt??

Während konfrontierte Leitern gekauft werden können, Sie können Ihre DNA -Leiter auch im Labor erstellen. Hier sind einige allgemeine Vorbereitungsmethoden:

• Beschränkungsenzymverdauung von Plasmid-DNA– Plasmide werden mit Enzymen wie Hindiii oder Ecori geschnitten, um Fragmente spezifischer Größe zu befreien.
• Verstärkung durch PCR– Zielsequenzen unterschiedlicher Längen werden einzeln verstärkt und dann zu einer Leiter kombiniert.
• Teilweise Verdauung von Concatamers– Tandem -Wiederholungen einer DNA -Sequenz sind gespalten, um Multimere zu produzieren.
• Synthetische Oligonukleotidhybridisierung– Kurze einsträngige DNA-Fragmente werden in doppelsträngige Multimere geglüht.

Unabhängig von der Produktionsmethode, Der Schlüssel erzeugt eine Reihe diskreter Bänder, die den gewünschten Größenbereich abdecken.

Wie wird eine DNA -Leiter verwendet??

Jetzt, wo Sie verstehen, was eine DNA -Leiter ist, Wie wird es verwendet?? DNA -Leitern dienen zwei wesentlichen Zwecken:

1. Größenschätzung

Indem Sie eine DNA -Leiter neben Ihren PCR -Proben auf einem Agarose- oder Polyacrylamidgel laufen lassen, Sie können die Größe Ihrer unbekannten DNA -Fragmente schätzen.

Während der Elektrophorese, Die Leiter und die Proben wandern mit Raten, die von ihrer Größe abhängig sind. Kleinere Fragmente reisen weiter im Gel nach unten, während größere Fragmente zurückbinden.

Wenn die DNA gefärbt und sichtbar ist, Die Leiterfragmente erscheinen als scharf, Diskrete Bänder. Indem Sie Ihre Probenbänder mit Leiterbändern mit passender Größe anstellen, Sie können die ungefähre Länge Ihrer PCR -Produkte bestimmen.

2. Qualitätskontrolle

Die Aufnahme einer DNA -Leiter dient auch als visuelle Kontrolle, die Ihre PCR -Verstärkung funktioniert hat. Wenn Sie verschiedene Probenbänder beobachten, die an den erwarteten Positionen relativ zur Leiter migrieren, Dies bietet eine schnelle Bestätigung, dass Ihre PCR erfolgreich war.

Wenn Sie keine Bands sehen, Die Leiter zeigt an, dass die Elektrophorese selbst ordnungsgemäß durchgeführt wurde. Dies deutet darauf hin, dass Ihre PCR -Reaktion möglicherweise fehlgeschlagen ist und Fehlerbehebung erforderlich ist.

Welche DNA -Leiter der Größe sollte ich verwenden?

Mit der Vielfalt der DNA -Leitern erhältlich, Wie wählen Sie das richtige für Ihr Experiment aus?? Hier sind die Schlüsselfaktoren zu berücksichtigen:

• Größenbereich– Der Leiterbereich muss Ihre erwarteten PCR -Produktgrößen umfassen. Für Amplikons unter 1 kb, A 100 bp oder 1 KB -Leiter ist geeignet. Für größere Produkte, Wählen Sie eine höhere Leiter wie 5 kb oder 10 kb.
• Bandabstand– Leitern mit mehr Referenzbändern in einem bestimmten Größenbereich ermöglichen eine größere Größe der Größe. Jedoch, Die eng verteilten Bänder dauern länger, um sich vollständig zu lösen. Wenn die Zeit begrenzt ist oder Sie nur ungefähre Größen benötigen, Verwenden Sie eine Leiter mit weniger Fragmenten.
• Ladenfertig– Vorgefertigt, Leiter ladere Leitern garantieren genaue Bandintensitäten. Vermeiden Sie es, selbst Leitern zu verdünnen oder zu mischen.
• Beispielnummer– Für mehrere Proben, Wählen Sie eine größere Leiterspurgröße, um einen Vergleich von nebeneinander zu ermöglichen.
• Budget – Berücksichtigen Sie die Kosten bei der Erzeugung großer Gelevolumina. Einige Leitern sind wirtschaftlicher.

Wie lese ich eine DNA -Leiter?

Sobald Ihr Gel nach der Elektrophorese sichtbar ist, Wie lesen Sie die Leiter, um die PCR -Produktgrößen zu bestimmen?? Befolgen Sie diese Schritte:

1. Identifizieren Sie die Gassen, die die DNA -Leiterfragmente enthalten. Dies wird normalerweise in der ersten und/oder letzten Fahrspur beladen.
2. Beachten Sie die Größe des Basispaar -DNA -Banden basierend auf dem Referenzdiagramm des Leiterherstellers. Leitern sind farbcodiert für das einfache Lesen.
3. Vergleichen Sie Ihre unbekannten Beispielbänder mit der Leiter, Identifizierung der engsten Band in der Leiterspur. Die Größe Ihres Bandes entspricht diesem Leiterfragment annähernd.
4. Für größere Präzision, Bandgröße zwischen zwei Leiterfragmenten interpolieren. Zum Beispiel, Wenn deine Band zwischen den läuft 500 Und 600 BP Ladder Bands, schätzen seine Größe als 550 bp.
5. Erhöhung der Größegenauigkeit, Führen Sie Gele länger aus, um die Trennung zwischen Leiterbändern zu maximieren. Das Laden kleinerer Mengen Leiter kann auch die Bandauflösung verbessern.

Was sind einige Beispiele für häufig verwendete DNA -Leitern?

Viele Arten von DNA -Leitern sind von Herstellern wie New England Biolabs erhältlich, Thermofisher, und Invitrogen. Einige häufig verwendete Optionen umfassen:

• 100 BP -DNA -Leiter – Enthält 12 Fragmente von 100 bp zu 1,500 bp. Ideal für PCR -Produkte unter 1,000 bp.
• 1 KB -DNA -Leiter– Zusammengesetzt aus 13 Bands von 250 bp zu 10,000 bp. Gut geeignet für Amplikons bis zu 10 kb.
• 1 KB plus DNA -Leiter– Erweiterte Version von 1 KB -Leiter mit zusätzlichen Fragmenten mit hohem und niedrigem Molekulargewicht.
• FastDigest DNA Leiter– Vorverdaute Leiter für direktes Laden auf Gele. Weniger Bands ermöglichen schnelle Laufzeiten.
• DNA -Leiter mit hohem Molekulargewicht – Enthält größere DNA -Fragmente bis zu 48,500 BP zur Größe von genomischer DNA mit hohem Molekulargewicht.

Wie bereite ich eine DNA -Leiter vor und lade ich?

Um die vollen Vorteile Ihrer DNA -Leiter zu nutzen, Die ordnungsgemäßen Vorbereitungs- und Ladetechniken sind der Schlüssel:

• Überprüfen Sie die Leiterintegrität vor dem Gebrauch – Überprüfen Sie auf Bandenverschmutzung oder Verschlechterung.
• Sanft mischen – Vermeiden Sie kräftiges Wirbel.
• Verwenden Sie den Hersteller empfohlenen Beträge – Unterlastung ergibt eine schwache Bandintensität. Überlastung verursacht Sättigung.
• Laden Sie die Leiter in der ersten und/oder letzten Spur auf – Bietet eine Größenreferenz auf beiden Seiten Ihrer Proben.
• Fügen Sie eine Spur ohne Leiter ein – Dient als Kontaminationskontrolle.

Wenn Sie diesen Best Practices folgen, erhalten Sie jedes Mal eine optimale Leistung der Leiter.

Wie erstelle ich meine DNA -Leiter?

Beim Kauf von vorgefertigten Leitern ist der einfachste Weg, Sie können Ihre DNA -Leiter auch mit PCR- und Restriktionsverdauung herstellen. Hier ist ein Überblick über den Prozess:

1. Design -PCR -Primer zur Amplifikation spezifischer Zielsequenzen unterschiedlicher Längen, wie zum Beispiel 500, 750, 1,000, Und 1,500 bp.
2. Führen Sie einzelne PCRs mit jedem Primerpaar aus, um DNA -Fragmente einer definierten Größe zu erzeugen.
3. Reinigen Sie die PCR -Produkte und quantifizieren Sie die DNA -Konzentration für jedes Fragment.
4. Verdauen Sie die Fragmente mit demselben Restriktionsenzym, um kompatible klebrige Enden zu erzeugen.
5. Mischen Sie die Fragmente in bestimmten Molverhältnissen, um die gewünschten Bandintensitäten zu erreichen.
6. Lagen Sie die Fragmente, um Multimere zu bilden, die durch Restriktionsstellen getrennt sind.
7. Verstärken Sie die Verwendung von universellen Primern, um Concatamers zu erzeugen.
8. Teilweise verdauen Concatamer mit einem originalen Restriktionsenzym, um an internen Stellen zu schneiden.
9. Reinigen und mischen Sie die Verdauungen in Ihre endgültige DNA -Leiter.

Warum sind DNA -Leitern für PCR so wichtig??

DNA -Leitern sind für die Polymerasekettenreaktion wesentlich (PCR) Anwendungen aus mehreren wichtigen Gründen:

Genauigkeit und Reproduzierbarkeit

DNA -Leitern ermöglichen eine genaue Größe und eine konsistente Reproduzierbarkeit der PCR -Ergebnisse. Indem Sie Ihre Bänder mit den Molekulargewichtsstandards der Leiter vergleichen, Sie können die Amplikongröße genau bestimmen und eine erfolgreiche Zielverstärkung bestätigen. Auf diese Weise können die Ergebnisse über verschiedene Benutzer hinweg zuverlässig reproduziert werden, Ausrüstung, und Labors.

Standardisierung

Einschließlich einer DNA -Leiter standardisiert Vergleiche zwischen mehreren PCR -Proben. Unabhängig davon, ob Sie verschiedene Bedingungen einer Probe analysieren oder zahlreiche Patientenproben untersuchen, Die Leiter liefert einen ständigen Verweis, um die Ergebnisse zu bewerten. Die Standardisierung ist für die Konsistenz in der Forschung und die klinische Diagnostik von entscheidender Bedeutung.

Optimierung

Leitern ermöglichen die PCR. Unerwartete Bandgrößen oder schwache Intensität zeigen suboptimale Bedingungen. Die Leiter hilft bei der Fehlerbehebungsprotokolle, um die besten Primer abzuleiten, Fahrradbedingungen, und Probenreinheit.

Empfindlichkeit

Mit einer breiten Range -Leiter, Sogar schwache PCR -Bänder können sichtbar gemacht und dimensioniert werden. Dies ermöglicht die Erkennung von Kopien mit niedrigen Vorlagen, die für Anwendungen wie die Überwachung der Viruslast kritisch sind. Die Empfindlichkeit einer Leiter unterstützt die Verwendung von PCR bei der Erkennung von Einzelmolekülen.

Multiplexing

Für Multiplex -PCR mit mehreren Primer -Sätzen, Leitern überprüfen die Identität jedes Zielbandes. Dies ermöglicht eine effiziente Verstärkung mehrerer Sequenzen in einer Reaktion.

Automatisierung

DNA -Leitern ermöglichen eine automatische Softwareanalyse von PCR -Gelen. Computeralgorithmen stützen sich auf die Leiter, um Bandmigrationsunterschiede zwischen Gelen zu normalisieren. Dies ermöglicht Hochdurchsatz, Schnelle Analyse großer Stichprobenzahlen.

Zusamenfassend, DNA -Leitern ermöglichen die PCR mit Genauigkeit, Reproduzierbarkeit, Standardisierung, Optimierung, Empfindlichkeit, Multiplexing -Fähigkeit, und Automatisierung. Egal, ob Sie ein neues Protokoll perfektionieren oder klinische Proben analysieren, Dieses wesentliche Tool verstärkt Ihren Erfolg und unterstützt hervorragende Forschungsergebnisse.