¿Qué es una escalera de ADN?? ¿Qué hace la escalera del ADN en la PCR??

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha revolucionado la investigación y el diagnóstico de biología molecular. Esta técnica versátil permite una amplificación exponencial de secuencias de ADN objetivo en solo unas pocas horas. Pero, ¿cómo sabes si tu PCR funcionó?? Y si generó el producto esperado, ¿Cómo puede determinar su tamaño preciso?? Aquí es donde entran las escaleras de ADN.

¿Qué es una escalera de ADN??

Una escalera de ADN contiene fragmentos de ADN de conocidos, tamaños específicos. Al igual que una regla con marcas en pulgadas o centímetros, Una escalera de ADN actúa como una referencia de tamaño al ejecutar electroforesis en gel. Comparando sus bandas de muestra de PCR con los fragmentos de escalera, Puede estimar el tamaño de sus fragmentos de ADN desconocidos.

Las escaleras de ADN están compuestas de moléculas de ADN que van desde 100 pares de bases para 10,000 pares de bases. Los fragmentos a menudo son múltiplos de 100 o 1,000 pares de bases. Escaleras con intervalos de 100 BP es lo mejor para determinar el tamaño de los productos de PCR pequeños, mientras 1 Las escaleras de KB funcionan mejor para amplicones más grandes.

¿Cómo se hace una escalera de ADN??

Mientras se pueden comprar escaleras preparadas, También puedes crear tu escalera de ADN en el laboratorio. Aquí hay algunos métodos de preparación comunes:

• Restricción Digestión enzimática de ADN plásmido– Los plásmidos se cortan con enzimas como hindiii o ecori para liberar fragmentos de tamaño específico.
• Amplificación por PCR– Las secuencias objetivo de longitudes variables se amplifican individualmente y luego se combinan en una escalera.
• Digestión parcial de concatamers– Las repeticiones en tándem de una secuencia de ADN se escinden para producir multímeros.
• Hibridación de oligonucleótidos sintéticos– Los fragmentos de ADN monocatenos cortos se recocen en multímeros de doble cadena.

No importa el método de producción, La clave es generar un conjunto de bandas discretas que cubren el rango de tamaño deseado.

¿Cómo se usa una escalera de ADN??

Ahora que entiendes lo que es una escalera de ADN, ¿Cómo se usa?? Las escaleras de ADN tienen dos propósitos esenciales:

1. Estimación de tamaño

Al ejecutar una escalera de ADN junto a sus muestras de PCR en un gel de agarosa o poliacrilamida, Puede estimar el tamaño de sus fragmentos de ADN desconocidos.

Durante la electroforesis, La escalera y las muestras migran a través de la matriz de gel a tasas que dependen de su tamaño. Los fragmentos más pequeños viajan más abajo en el gel, mientras que los fragmentos más grandes retrasan.

Cuando el ADN se mancha y visualiza, Los fragmentos de la escalera aparecen como agudos, bandas discretas. Alineando sus bandas de muestra con bandas de escalera de tamaño coincidente, Puede determinar la longitud aproximada de sus productos de PCR.

2. Control de calidad

La inclusión de una escalera de ADN también sirve como un control visual que funcionó su amplificación por PCR. Cuando observa distintas bandas de muestra que migran en las posiciones esperadas en relación con la escalera, Esto proporciona una confirmación rápida de que su PCR tuvo éxito.

Si no ves ninguna banda, la escalera indica que la electroforesis en sí se realizó correctamente. Esto sugiere que su reacción de PCR puede haber fallado y se necesita solución de problemas.

¿Qué tamaño de escalera de ADN debo usar??

Con la variedad de escaleras de ADN disponibles, ¿Cómo eliges el adecuado para tu experimento?? Estos son los factores clave a considerar:

• Rango de tamaño– La gama de escaleras debe abarcar los tamaños de PCR esperados. Para amplicones debajo 1 kb, a 100 BP o 1 La escalera de KB es adecuada. Para productos más grandes, Elija una escalera más alta como 5 KB o 10 kb.
• Espaciado de la banda– Las escaleras con más bandas de referencia en un rango de tamaño dado permiten una mayor precisión de tamaño. Sin embargo, Las bandas muy espaciadas tardan más en resolver por completo. Si el tiempo es limitado o solo necesita tamaños aproximados, Use una escalera con menos fragmentos.
• Listo para cargar– Preferido, Las escaleras listas para cargar garantizan intensidades de banda precisas. Evite diluir o mezclar escaleras.
• Número de muestra– Para múltiples muestras, Elija un tamaño de carril de escalera más grande para permitir una comparación de lado a lado.
• Presupuesto – Considere el costo si produce grandes volúmenes de geles. Algunas escaleras son más económicas.

¿Cómo leo una escalera de ADN??

Una vez que su gel se visualice después de la electroforesis, ¿Cómo se lee la escalera para determinar los tamaños de los productos de PCR?? Sigue estos pasos:

1. Identificar los carriles que contienen los fragmentos de escalera de ADN. Esto generalmente se carga en el primer y/o último carril.
2. Tenga en cuenta el tamaño de las bandas de ADN del par de bases basadas en la tabla de referencia del fabricante de la escalera. Las escaleras están codificadas por colores para una lectura fácil.
3. Compare sus bandas de muestra desconocidas con la escalera, Identificar la banda más cercana en el carril de la escalera. El tamaño de su banda es aproximado a ese fragmento de escalera.
4. Para mayor precisión, Tamaño de banda interpolada entre dos fragmentos de escalera. Por ejemplo, Si tu banda corre entre el 500 y 600 bandas de escalera de BP, estimar su tamaño como 550 pb.
5. Para aumentar la precisión del tamaño, Run geles más tiempo para maximizar la separación entre las bandas de escalera. Cargar cantidades más pequeñas de escalera también puede mejorar la resolución de la banda.

¿Cuáles son algunos ejemplos de escaleras de ADN de uso común??

Muchos tipos de escaleras de ADN están disponibles en fabricantes como New England Biolabs, Termofisher, e Invitrogen. Algunas opciones de uso común incluyen:

• 100 escalera de ADN de BP – Contiene 12 fragmentos de 100 BP a 1,500 pb. Ideal para productos de PCR bajo 1,000 pb.
• 1 escalera de ADN de KB– Compuesto por 13 bandas de 250 BP a 10,000 pb. Muy adecuado para los amplicones hasta 10 kb.
• 1 KB más escalera de ADN– Versión expandida de 1 Escalera de KB con fragmentos adicionales de alto y bajo peso molecular.
• Escalera de ADN de FastDigest– Escalera previamente digerida lista para la carga directa en geles. Menos bandas permiten tiempos de ejecución rápidos.
• Escalera de ADN de alto peso molecular – Contiene fragmentos de ADN más grandes hasta 48,500 BP para dimensionar ADN genómico de alto peso molecular.

¿Cómo preparo y cargo una escalera de ADN??

Para aprovechar los beneficios completos de su escalera de ADN, Las técnicas adecuadas de preparación y carga son clave:

• Verifique la integridad de la escalera antes de usar – Inspeccionar por cualquier bandera o degradación de la banda.
• Mezclar suavemente – Evite el vórtice vigoroso para evitar el ADN de cizallamiento.
• Utilizar cantidades recomendadas por el fabricante – La subprocha da intensidad de banda débil. La sobrecarga causa saturación.
• Cargar escalera en primer y/o último carril – Proporciona una referencia de tamaño en ambos lados de sus muestras.
• Incluir un carril sin escalera – Sirve como control de contaminación.

Seguir estas mejores prácticas le dará un rendimiento óptimo de escalera cada vez.

¿Cómo creo mi escalera de ADN??

Mientras que comprar escaleras prefabricadas es la ruta más fácil, También puede hacer su escalera de ADN con PCR y digestión de restricción. Aquí hay una descripción general del proceso:

1. Diseñar cebadores de PCR para amplificar secuencias objetivo específicas de longitudes variables, como 500, 750, 1,000, y 1,500 pb.
2. Ejecute PCR individuales usando cada par de cebadores para generar fragmentos de ADN de un tamaño definido.
3. Purificar los productos de PCR y cuantificar la concentración de ADN para cada fragmento.
4. Digerir los fragmentos con la misma enzima de restricción para generar extremos pegajosos compatibles.
5. Mezcle los fragmentos en relaciones molar específicas para lograr las intensidades de banda deseadas.
6. Ligate los fragmentos para formar multímeros separados por sitios de restricción.
7. Amplificar el uso de cebadores universales para generar concatamers.
8. Digir parcialmente los concatamers con una enzima de restricción original para cortar en sitios internos.
9. Purificar y mezclar las digestión en su escalera de ADN final.

¿Por qué son tan importantes para PCR tan importantes para la PCR??

Las escaleras de ADN son esenciales para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) aplicaciones por varias razones clave:

Precisión y reproducibilidad

Las escaleras de ADN permiten un tamaño preciso y una reproducibilidad constante de los resultados de PCR. Comparando sus bandas con los estándares de peso molecular de la escalera, Puede determinar con precisión el tamaño del amplicón y confirmar la amplificación del objetivo exitoso. Esto permite que los resultados se reproduzcan de manera confiable en diferentes usuarios, equipo, y laboratorios.

Normalización

La inclusión de una escalera de ADN estandariza las comparaciones entre múltiples muestras de PCR. Ya sea que esté analizando diferentes condiciones de una muestra o detectar numerosas muestras de pacientes, la escalera proporciona una referencia constante para evaluar los resultados. La estandarización es crítica para la consistencia en la investigación y el diagnóstico clínico.

Mejoramiento

Las escaleras facilitan la optimización de PCR al indicar si la amplificación se produce como se esperaba. Los tamaños de banda inesperados o la intensidad débil revelan condiciones subóptimas. La escalera ayuda a solucionar protocolos, condiciones de ciclismo, y pureza de muestra.

Sensibilidad

Con una escalera de amplio rango, Incluso las bandas de PCR débiles se pueden visualizar y dimensionar. Esto permite la detección de copias de baja plantilla crítica para aplicaciones como el monitoreo de la carga viral. La sensibilidad proporcionada por una escalera admite el uso de PCR en la detección de una sola molécula.

Multiplexación

Para PCR multiplex con varios conjuntos de cebadores, Las escaleras verifican la identidad de cada banda objetivo. Esto permite una amplificación eficiente de múltiples secuencias en una reacción.

Automatización

Las escaleras de ADN habilitan el análisis automático de software de los geles de PCR. Los algoritmos de la computadora dependen de la escalera para normalizar las diferencias de migración de la banda entre los geles. Esto permite un alto rendimiento, Análisis rápido de grandes números de muestra.

En breve, Las escaleras de ADN empoderan a PCR con precisión, reproducibilidad, normalización, mejoramiento, sensibilidad, capacidad de multiplexación, y automatización. Si está perfeccionando un nuevo protocolo o analizando muestras clínicas, Esta herramienta esencial amplificará su éxito y apoyará excelentes resultados de investigación..