Соларбио Пируваткарбоксилаза (ПК) Набор для анализа активности

Пируваткарбоксилаза (ПК) Набор для анализа активности

Примечание: Перед тестированием возьмите два или три разных образца для прогнозирования..

Операционное оборудование: Спектрофотометр

Кот нет: BC0730

Размер:50Т/48С

Компоненты:

Экстракт раствора: Жидкость 110 мл×1. Хранение при 4℃.

Реагент I: Жидкость 30 мл×1. Хранение при 4℃.

Реагент II: Жидкость 10 мл×1. Хранение при 4℃.

Реагент III: Порошок×1. Хранение при -20℃. Растворить с 5 мл дистиллированной воды, store at -20℃ after prepared.

Реагент IV: Порошок×1. Хранение при -20℃. Растворить с 5 мл дистиллированной воды, store at -20℃ after prepared.

Реагент V: Жидкость 5 мл×1. Хранение при 4℃.

Реагент VI: Жидкость 15 мкл × 1. Хранение при 4℃.

Reagent VI Diluent Solution: Жидкость 10 мл×1. Хранение при 4℃.

Описание продукта:

Pyruvate carboxylase (ПК, ЕС 6.4.1.1) is widely present in mitochondria of animals, molds and yeast, but is not found in plants and most bacteria. PC is the main postreaction for oxaloacetate, and is the first-rate- limiting enzyme in the gluconeogenesis process.

PC irreversibly catalyzes pyruvate, СПС, CO2 and water to oxaloacetate, ADP and Pi, malic dehydrogenase further catalyzes the formation of malic acid and NAD+ from acetoacetic acid and NADH. The enzyme activity of PC can be reflected by detecting the oxidation rate of NADH at 340 нм.

Требуемые реагенты и оборудование, которые не входят в комплект поставки:

Ультрафиолетовый спектрофотометр, водяная баня, настольная центрифуга, водяная баня, регулируемая пипетка, 1 мл кварцевая кювета, ступка/гомогенизатор, лед и дистиллированная вода.

Процедура:

я. Complex extraction:

• Collecting 0.1 g of tissue or 5 миллион клеток, добавлять 1 мл раствора экстракта, grinding on ice with mortar/homogenizer.
• Центрифуга в 1000 ×g для 10 minutes at4℃,
• Take the supernatant to other tube and centrifuge at 11000 ×g для 15 minutes at4℃.
• The supernatant is used to detect PC that leaking from mitochondria, which shows the effect of mitochondrial extraction.
• Добавлять 1 mL of Extract solution to the sediment, splitting with ultrasonic (власть 20%, рабочее время 5 с, интервал 10 с, повторить 12 раз), used to detect the enzyme activity of PC and protein content.

II. Определение процедура:

• Preheat ultraviolet spectrophotometer for 30 минуты, отрегулировать длину волны, чтобы 340 нм, установить ноль с помощью дистиллированной воды.
• Preheat Reagent I at 37℃ for 15 минуты.
• Diluent Reagent VI according to the volume ratio of Reagent VI: Reagent VI Diluent Solution = 1.6:660(В:В), prepare the reagent when it will be used.
• Рабочее решение: make the solution as the volume ratio of Reagent II: Реагент III: Reagent IV= 2:1:1, prepare the reagent when it will be used.
• Добавьте следующие реагенты в 1 мл кварцевая кювета:

Реагент (мкл)	Пустая трубка (Б)	Пробирка (Т)
Реагент I	450	450
Рабочее решение	320	320
Реагент V	80	80
Реагент VI	100	100
Образец	—	50
Дистиллированная вода	50	—
Add the above reagents to the 1 mL quartz cuvette in order, timing after add working solution, тщательно перемешать. Определить поглощение при 340 nm at the time of 10 секунды, record as AT1 or AB1. Then place dishes with the reaction solution in a 37℃ water bath for 2 минуты. Take it out and wipe it clean, immediately measure the absorbance at the time of 130 секунды, which record as AT2 or AB2. ΔAT= AT1- AT2, ΔAb = ab1- AB2, ΔA= ΔAT-ΔAB. The blank tube only need to test once or twice.

III. Расчет:

Определение единицы измерения: One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme catalyzes the production of 1 nmol of NADH per minute every milligram of protein.

PC Activity(Ед/мг прот)"="[ΔA × VRV ÷(ε×d)× 109]÷(Vs×Cpr)÷T =1607×ΔA÷Cpr

 

е: Молярный коэффициент экстинкции НАДН, 6.22×103 L/mol/cm; д: Световой путь кюветы, 1 см;

Веревка: Общий объем реакции,1×10-3 л; Против: Объем образца (мл), 0.05 мл;

КПР: Концентрация белка образца (мг/мл); Т: Время реакции (мин), 2 минуты;

109: 1 mol=109 nmol.

Примечание:

1. Take one or two different samples for prediction before test. It is recommended to dilute the crude enzyme solution with the Extract solution before the determination if the ΔA>0.8(if measuring with 96 well flat-bottom UV plate, ΔА>0.5). Пока, extending the response time (5 minutes or 10 минуты) if ΔA <0.01.

2. The blank tube is a detection hole for detecting the quality of each reagent component, and normally that the change of ΔAB does not exceed 0.05.
3. The protein concentration of the sample needs to be determined by yourself. Since the Extract solution contains a relatively high protein concentration (о 1 мг/мл), the protein concentration of the Extract solution must be deducted when measuring the protein concentration of the sample.

4. Рекомендуется использовать концентрацию белка образца для расчета активности фермента. Если для расчета используется свежий вес образца свежего веса, необходимо измерить ферментативную активность цитоплазматического экстракта, и сумма активности ферментов супернатанта и осадков является общей ферментной активностью.
5. Reagents in this kit are sufficient to complete 50 трубчатые реакции.
6. Appendix: calculation formula of sample weight: (sample test number is50T/24S)

1) Супернатант:

Определение единицы измерения: One unit of enzyme activity is the amount of enzyme catalyzes the production of 1 nmol of NADH per minute every gram of tissue.

PC Activity (Е/г веса) "="[ΔA1 × VRV ÷(ε×d)× 109]÷(Вт÷Ve×Vs)÷T =1607×ΔA1÷W

ΔA1: Supernatant absorbance;

е: Молярный коэффициент экстинкции НАДН, 6.22×103 L/mol/cm; д: Световой путь кюветы, 1 см;

Веревка: Общий объем реакции,1×10-3 л; Против: Объем образца (мл), 0.05 мл; ве: Extraction solution, 1 мл;

КПР: Концентрация белка образца (мг/мл); Т: Время реакции (мин), 2 минуты;

109: 1 mol=109 nmol;

Вт: Вес образца, г.

2) Осадок:

Определение единицы измерения: One unit of enzyme activity is the amount of enzyme catalyzes the production of 1 nmol of NADH per minute every gram of tissue.

PC Activity (Е/г веса) "="[ΔA2 × VRV ÷(ε×d)× 109]÷(Вт÷Ve×Vs)÷T =1607×ΔA2÷W

ΔA2: Sediment absorbance;

е: Молярный коэффициент экстинкции НАДН, 6.22×103 L/mol/cm; д: Световой путь кюветы, 1 см;

Веревка: Общий объем реакции,1×10-3 л; Против: Объем образца (мл), 0.05 мл;

ве: Sediment heavy suspension volume, 1 мл; КПР: Концентрация белка образца (мг/мл); Т: Время реакции (мин), 2 минуты;

109: 1 mol=109 nmol;

Вт: Вес образца, г.

3) Total активность

Total activity is the sum of PC activity in supernatant and sediment. ПК(Е/г веса)=1607×ΔA1÷W+1607×ΔA2÷W.

Экспериментальный пример:

1. 1 mL of Extract solution is added to 0.1 g of rabbit heart tissue for homogenization. The supernatant is diluted 100 times with Extract solution, and the precipitation was diluted 4 раз. Затем, measured by microquartzplate according to the determination steps, Супернатант: the ΔAT = A1T — A2T = 1.104-0.856 =0.248, ΔAB = A1B — A2B = 1.021-0.988=0.033, Δ A1 = ΔAT — ΔAB = 0.248-0.033=0.215, precipitate: ΔAT = A1T — A2T = 1.07-0.716 =0.354, ΔAB= А1В- A2B = 1.021-0.988=0.033, ΔA2 = ΔAT- ΔAB =0.354-0.033= 0.321

Супернатант: the activity of PC (Ед/г массы) "=" 1607 × Δ A1 ÷ W × 100 (коэффициент разбавления) = 1607×0.215÷0.1× 100 "=" 345505 Ед/г массы;

Precipitation: the enzyme activity of PC (Ед/г массы) = 1607×ΔA2 ÷ W×4 (коэффициент разбавления) = 1607×0.321÷ 01.

× 4=20633.88 U/g mass;

The total enzyme activity of PC (Ед/г массы) = 1607×ΔA1÷W×100 (dilution) + 1607×ΔA2 ÷ W

=1607 × 0.215 ÷0.1×100+1607×0.321÷0.1×4=366138.88 U/g mass.

Рекомендации

[1] Esmail S. Kakey,Amez A. Ismael. Evaluation of Oxidative Stress Status in Aged Human in relation to some Diseases. International Conference on Pure and Applied Sciences. August 2018;

сопутствующие товары

BC0920/BC0925 Fructose 1,6-bisphosphatase (FBP) Набор для анализа активности

BC3320/BC3325 Glucose-6-phosphatase Activity Assay Kit

BC3310/BC3315 Phosphoenolpyruvate Carboxykinase (PEPCK) Набор для анализа активности