Solarbio Pyruvat-Carboxylase (PC) Aktivitätstest-Kit

Pyruvatcarboxylase (PC) Aktivitätstest-Kit

Notiz: Nehmen Sie vor dem Test zwei oder drei verschiedene Proben zur Vorhersage.

Betriebsausrüstung: Spektrophotometer

Katze nein: BC0730

Größe:50T/48S

Komponenten:

Lösung extrahieren: Flüssig 110 ml×1. Lagerung bei 4℃.

Reagenz I: Flüssig 30 ml×1. Lagerung bei 4℃.

Reagenz II: Flüssig 10 ml×1. Lagerung bei 4℃.

Reagenz III: Pulver×1. Lagerung bei -20℃. Mit auflösen 5 ml destilliertes Wasser, Nach der Zubereitung bei -20 °C lagern.

Reagenz IV: Pulver×1. Lagerung bei -20℃. Mit auflösen 5 ml destilliertes Wasser, Nach der Zubereitung bei -20 °C lagern.

Reagenz V: Flüssig 5 ml×1. Lagerung bei 4℃.

Reagenz VI: Flüssig 15 μL×1. Lagerung bei 4℃.

Reagenz VI-Verdünnungslösung: Flüssig 10 ml×1. Lagerung bei 4℃.

Produktbeschreibung:

Pyruvatcarboxylase (PC, EC 6.4.1.1) ist in den Mitochondrien von Tieren weit verbreitet, Schimmel und Hefe, kommt aber in Pflanzen und den meisten Bakterien nicht vor. PC ist die Hauptnachreaktion für Oxalacetat, und ist erstklassig- limitierendes Enzym im Prozess der Gluconeogenese.

PC katalysiert Pyruvat irreversibel, ATP, CO2 und Wasser zu Oxalacetat, ADP und Pi, Äpfelsäuredehydrogenase katalysiert außerdem die Bildung von Äpfelsäure und NAD+ aus Acetessigsäure und NADH. Die Enzymaktivität von PC kann durch die Bestimmung der Oxidationsrate von NADH widergespiegelt werden 340 nm.

Erforderliche, aber nicht bereitgestellte Reagenzien und Ausrüstung:

Ultraviolett-Spektrophotometer, Wasserbad, Tischzentrifuge, Wasserbad, verstellbare Pipette, 1 ml-Quarzküvette, Mörtel/Homogenisator, Eis und destilliertes Wasser.

Verfahren:

ICH. Komplexe Extraktion:

• Sammeln 0.1 g Gewebe bzw 5 Millionen Zellen, hinzufügen 1 ml Extraktlösung, Mahlen auf Eis mit Mörser/Homogenisator.
• Zentrifuge bei 1000 ×g für 10 Minuten bei 4℃,
• Den Überstand in ein anderes Röhrchen geben und zentrifugieren 11000 ×g für 15 Minuten bei 4℃.
• Der Überstand wird zum Nachweis von PC verwendet, der aus Mitochondrien austritt, Dies zeigt die Wirkung der mitochondrialen Extraktion.
• Hinzufügen 1 Geben Sie ml der Extraktlösung in das Sediment, Spaltung mit Ultraschall (Leistung 20%, Arbeitszeit 5s, Intervall 10s, wiederholen 12 mal), Wird zum Nachweis der Enzymaktivität von PC und des Proteingehalts verwendet.

II. Bestimmung Verfahren:

• UV-Spektrophotometer vorheizen 30 Protokoll, Passen Sie die Wellenlänge an 340 nm, Mit destilliertem Wasser auf Null stellen.
• Reagenz I auf 37℃ vorheizen 15 Protokoll.
• Verdünnungsreagenz VI entsprechend dem Volumenverhältnis von Reagenz VI: Reagenz VI Verdünnungslösung = 1.6:660(V:V), Bereiten Sie das Reagenz vor, wenn es verwendet werden soll.
• Funktionierende Lösung: Stellen Sie die Lösung als Volumenverhältnis von Reagenz II her: Reagenz III: Reagenz IV= 2:1:1, Bereiten Sie das Reagenz vor, wenn es verwendet werden soll.
• Fügen Sie die folgenden Reagenzien hinzu 1 ml-Quarzküvette:

Reagens (μL)	Leeres Rohr (B)	Reagenzglas (T)
Reagenz I	450	450
Funktionierende Lösung	320	320
Reagenz V	80	80
Reagenz VI	100	100
Probe	–	50
Destilliertes Wasser	50	–
Fügen Sie die oben genannten Reagenzien hinzu 1 mL-Quarzküvette in Ordnung bringen, Timing nach Zugabe der Arbeitslösung, gründlich mischen. Ermitteln Sie die Absorption bei 340 nm zum Zeitpunkt von 10 Sekunden, Aufnahme als AT1 oder AB1. Stellen Sie dann die Schalen mit der Reaktionslösung für 37 °C in ein Wasserbad 2 Protokoll. Nehmen Sie es heraus und wischen Sie es sauber, Messen Sie sofort die Extinktion zum Zeitpunkt von 130 Sekunden, die als AT2 oder AB2 aufzeichnen. ΔAT= AT1- AT2, ΔAB= AB1- AB2, ΔA= ΔAT-ΔAB. Das leere Röhrchen muss nur ein- oder zweimal getestet werden.

III. Berechnung:

Einheitendefinition: Eine Einheit Enzymaktivität ist definiert als die Menge an Enzym, die die Produktion von katalysiert 1 nmol NADH pro Minute pro Milligramm Protein.

PC-Aktivität(U/mg-Schutz)=[ΔA×Vrv÷(ε×d)×109]÷(Vs×Cpr)÷T =1607×ΔA÷Cpr

 

e: Molarer NADH-Extinktionskoeffizient, 6.22×103 L/mol/cm; D: Lichtweg der Küvette, 1 cm;

Seil: Gesamtreaktionsvolumen,1×10-3 L; Vs: Probenvolumen (ml), 0.05 ml;

Cpr: Proteinkonzentration der Probe (mg/ml); T: Reaktionszeit (Mindest), 2 Protokoll;

109: 1 mol=109 nmol.

Notiz:

1. Nehmen Sie vor dem Test eine oder zwei verschiedene Proben zur Vorhersage. Es wird empfohlen, die rohe Enzymlösung vor der Bestimmung des ΔA mit der Extraktlösung zu verdünnen>0.8(wenn messen mit 96 Well-UV-Platte mit flachem Boden, ΔA>0.5). Während, Verlängerung der Reaktionszeit (5 Minuten bzw 10 Protokoll) wenn ΔA <0.01.

2. Das leere Röhrchen ist ein Erkennungsloch zur Erkennung der Qualität jeder Reagenzkomponente, und normalerweise darf die Änderung von ΔAB nicht überschritten werden 0.05.
3. Die Proteinkonzentration der Probe muss selbst bestimmt werden. Da die Extraktlösung eine relativ hohe Proteinkonzentration enthält (um 1 mg/ml), Bei der Messung der Proteinkonzentration der Probe muss die Proteinkonzentration der Extraktlösung abgezogen werden.

4. Es wird empfohlen, die Proteinkonzentration der Probe zur Berechnung der Enzymaktivität zu verwenden. Wenn zur Berechnung das Frischgewicht der Probe verwendet wird, Die Enzymaktivität des Zytoplasmaextrakts muss gemessen werden, und die Summe aus Überstands- und Fällungsenzymaktivität ist die gesamte Enzymaktivität.
5. Die Reagenzien in diesem Kit reichen zur Vervollständigung aus 50 Röhrenreaktionen.
6. Anhang: Berechnungsformel des Probengewichts: (Beispieltestnummer ist 50T/24S)

1) Überstand:

Einheitendefinition: Eine Einheit der Enzymaktivität ist die Menge an Enzym, die die Produktion katalysiert 1 nmol NADH pro Minute pro Gramm Gewebe.

PC-Aktivität (U/g-Gewicht) =[ΔA1×Vrv÷(ε×d)×109]÷(W÷Ve×Vs)÷T =1607×ΔA1÷W

ΔA1: Absorption des Überstandes;

e: Molarer NADH-Extinktionskoeffizient, 6.22×103 L/mol/cm; D: Lichtweg der Küvette, 1 cm;

Seil: Gesamtreaktionsvolumen,1×10-3 L; Vs: Probenvolumen (ml), 0.05 ml; Ve: Extraktionslösung, 1 ml;

Cpr: Proteinkonzentration der Probe (mg/ml); T: Reaktionszeit (Mindest), 2 Protokoll;

109: 1 mol=109 nmol;

W: Probengewicht, G.

2) Sediment:

Einheitendefinition: Eine Einheit der Enzymaktivität ist die Menge an Enzym, die die Produktion katalysiert 1 nmol NADH pro Minute pro Gramm Gewebe.

PC-Aktivität (U/g-Gewicht) =[ΔA2×Vrv÷(ε×d)×109]÷(W÷Ve×Vs)÷T =1607×ΔA2÷W

ΔA2: Sedimentabsorption;

e: Molarer NADH-Extinktionskoeffizient, 6.22×103 L/mol/cm; D: Lichtweg der Küvette, 1 cm;

Seil: Gesamtreaktionsvolumen,1×10-3 L; Vs: Probenvolumen (ml), 0.05 ml;

Ve: Sedimentreiches Suspensionsvolumen, 1 ml; Cpr: Proteinkonzentration der Probe (mg/ml); T: Reaktionszeit (Mindest), 2 Protokoll;

109: 1 mol=109 nmol;

W: Probengewicht, G.

3) Gesamt Aktivität

Die Gesamtaktivität ist die Summe der PC-Aktivität im Überstand und Sediment. PC(U/g-Gewicht)=1607×ΔA1÷W+1607×ΔA2÷W.

Experimentelles Beispiel:

1. 1 Es werden ml Extraktlösung hinzugefügt 0.1 g Kaninchenherzgewebe zur Homogenisierung. Der Überstand wird verdünnt 100 mal mit Extraktlösung, und der Niederschlag wurde verdünnt 4 mal. Dann, gemessen mittels Mikroquarzplatte gemäß den Bestimmungsschritten, Überstand: das ΔAT = A1T – A2T= 1.104-0.856 =0,248, ΔAB = A1B – A2B = 1,021-0,988 = 0,033, Δ A1 = ΔAT – ΔAB = 0,248-0,033=0,215, Präzipitat: ΔAT = A1T – A2T= 1.07-0.716 =0,354, ΔAB= A1B- A2B = 1,021-0,988 = 0,033, ΔA2 = ΔAT- ΔAB =0,354-0,033= 0.321

Überstand: die Aktivität des PCs (U/g-Masse) = 1607 × Δ A1 ÷ W × 100 (Verdünnungsverhältnis) = 1607×0,215÷0,1× 100 = 345505 U/g-Masse;

Fällung: die Enzymaktivität von PC (U/g-Masse) = 1607×ΔA2 ÷ B×4 (Verdünnungsverhältnis) = 1607×0,321÷ 01.

× 4=20633,88 U/g Masse;

Die gesamte Enzymaktivität von PC (U/g-Masse) = 1607×ΔA1÷W×100 (Verdünnung) + 1607×ΔA2 ÷ W

=1607 × 0.215 ÷0,1×100+1607×0,321÷0,1×4=366138,88 U/g Masse.

Verweise

[1] Esmail S. Kakey,Amez A. Ismael. Bewertung des oxidativen Stressstatus bei älteren Menschen in Bezug auf einige Krankheiten. Internationale Konferenz für reine und angewandte Wissenschaften. August 2018;

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