Соларбио пирофосфат: Фруктоза 6-фосфат-1 набор для анализа фосфотрансферазы

Атрибут	Подробности
Примечание	Перед тестированием возьмите два или три разных образца для прогнозирования.
Инструмент обнаружения	Спектрофотометр
Кот нет	BC3400
Размер	50Т/48С

Компоненты:

Экстракт раствора: 55мл × 1, хранится в 4 °С.

Реагент 1: 40мл × 1, хранится в 4 ° C и защищен от света.

Реагент 2: Порошок × 1, хранится в -20 ° C и защищен от света. Непосредственно перед использованием, добавлять 6 мл дистиллированной воды для полного растворения. Неиспользованные реагенты хранятся в -20 °С для 1 Неделя после выдачи, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания.

Реагент 3: порошок × 1, хранится в -20 ° C и защищен от света. Непосредственно перед использованием, добавлять 6 мл дистиллированной воды для полного растворения. Неиспользованные реагенты хранятся в -20 ° C после дозирования. Запрет повторных циклов замораживания-оттаивания.

Реагент 4: 91мкл × 2, хранится в 4 ° C и защищен от света. Непосредственно перед использованием, добавлять 0.209 мл дистиллированной воды для полного растворения. Хранится в 4 °С для 1 неделя.

Реагент 5: Порошок × 2, хранится в -20 ° C и защищен от света. Непосредственно перед использованием, добавлять 0.3 мл дистиллированной воды для полного растворения. Неиспользованные реагенты хранятся в -20 °С для 1 неделя после дозирования.

Реагент 6: 60 мкл × 1, хранится в 4 ° C и защищен от света. Непосредственно перед использованием, добавлять 0.6 мл дистиллированной воды для полного растворения. Хранится в 4 °С для 1 неделя.

Описание продукта:

Пирофосфат: Фруктоза-6-фосфат-1-фосфотрансфераза (ПФП, EC2.7.1.90) является цитозольным ферментом, который широко присутствует в тканях растений и катализирует фосфорилирование фруктозо-6-фосфата, подобного фосфофруктокиназе. Как результат, Единственная каталитическая реакция PEP является обратимой реакцией, и пирофосфат используется вместо АТФ, который играет важную роль в метаболизме углерода фотосинтеза.

PFP катализирует превращение фруктозы 6-фосфата в фруктозу 1,6-дифосфат, который преобразуется в фосфат дигидроксиацетона путем действия альдолазы и триозофосфат -изомеразы, а затем катализируется α-фосфатной глицеролдегидрогеназой и NADH до глицерина 3-дифосфата и NAD. Изменение поглощения в 340 NM отражает уровень активности PFP.

Требуемый материал

Низкая температура центрифуга, спектрофотометр, водяная баня/инкубатор с постоянной температурой, ступка/гомогенизатор, 1 мл кварцевая кювета, пипетка для переноса, лед и дистиллированная вода, EP трубка.

Процедура:

я. Образец Добыча:

1. 1. Образец ткани:

В соответствии с массой ткани (г): объем раствора экстракта (мл) является 1: 5 ~ 10. Предполагается 0,1 г ткани с 1 мл раствора экстракта. Полностью размолоть на льду, центрифугированы в 20000 г и 4 ℃ для 15 мин. Супернатант помещается на льду для тестирования.

2. Бактерии или клетки:

В соответствии с количеством ячеек (104): объем раствора экстракта (мл) является 500 ~ 1000: 1. Рекомендую 5 миллион с 1 мл раствора экстракта. Используйте ультразвуковое значение для разделения бактерий или клеток (мощность 300 Вт, время работы 3с, интервал 7 секунд, общее время 3 мин). Центрифугированы в, 20000G и 4 ℃ для 15 мин. Супернатант помещается на льду для тестирования.

3. Жидкости: прямое обнаружение.

II. Определение процедура:

• Разогрейте спектрофотометр 30 мин, отрегулировать длину волны, чтобы 340 нм, установить ноль с дистиллированным
• Добавьте реагенты из следующего списка:

Название реагента (мкл)	Пробирка (Т)	Пустая трубка (Т)
Реагент 1	670	670
Реагент 2	100	100
Реагент 3	100	100
Реагент 4	10	10
Реагент 5	10	10
Реагент 6	10	10
Образец	100	—
Дистиллированная вода	—	100
После тщательного перемешивания, измерить начальное значение A1 в 340 NM и поглощение A2 для 30 минут в 37 ° C в а 1 мл кварцевая кювета, и записать их как A1T, А1Б, и A2t, А2Б. Рассчитайте ΔA = (A1T-A2T)- (A1B-A2B). Примечание: Реагенты 1, 2, 3, 4, 5, и 6 Также можно сформулировать в рабочие жидкости в соответствии с пропорциями операционной таблицы, который теперь готов к использованию; Пустые трубки должны быть только Сделано 1–2 раза.

III. Расчет PFP активность:

1 Рассчитано по микро -кварцевой кювете

• Рассчитывается концентрацией белка:

Определение единицы измерения: Одна единица активности фермента определяется как это 1 мг белка ткани в минуту потребляет 1 НМОЛ НАДХ.

Активность ПФП (Ед/мг прот) = ΔA ÷ (ε × D) × VRT × 109 ÷(Против × cpr) ÷ t = 53,59 × ΔA ÷ cpr

• Рассчитано по весу выборки

Определение единицы измерения: Одна единица активности фермента определяется как то, что 1 г ткани в минуту потребляет 1 НМОЛ НАДХ.

Активность ПФП (U/g свежий вес) = ΔA ÷ (ε × D) × VRT × 109 ÷(W × vs ÷ ve) ÷ t = 53,59 × ΔA ÷ w

• Рассчитывается по бактериям или количеству клеток:

Определение единицы измерения: Одна единица активности фермента определяется как это 10 тысяча бактерий или клетки в минуту потребляют 1 НМОЛ НАДХ.

Активность ПФП (Ячейка U / 104) = ΔA ÷ (ε × D) × VRT × 109 ÷(Против × n ÷ ve) ÷ t = 53,59 × ΔA ÷ n (104)

• Рассчитывается сывороткой и другими жидкостями:

Определение единицы измерения: Одна единица активности фермента определяется как это 1 Ml жидкостей в минуту потребляет 1 НМОЛ НАДХ.

Активность ПФП (Ед/мл) = ΔA ÷ (ε × D) × VRT × 109 ÷ против ÷ T = 53,59 × ΔA

ВРТ: Общий объем реакционной системы, 0.001 л;

е: Молярный коэффициент экстинкции НАДН, 6.22 × 103 L/моль/см; д: Кюветт легкий путь, 1 см;

ПРОТИВ: Добавленный объем образца, 0.1 мл;

ВЕ: объем экстрактного раствора добавлено, 1 мл; Т: время реакции, 30 мин;

КПР: концентрация белка в образце, мг/мл; Вт: масса образца, 0.1 г;

109:коэффициент преобразования, 1 моль = 109 nmol n: Количество ячейки

2. Рассчитано по 96-луночной ультрафиолетной пластине:

Изменить d = 1 CM в вышеупомянутой формуле к D-0.6 см (легкий путь 96-луночной пластины) для расчета.

Примечание:

1. Количество образцов не должно быть слишком большим, чтобы избежать откладывания времени ферментативной реакции.

Экспериментальные примеры:

1. Брать 0.1 г ростки бобов и добавить 1 мл раствора экстракта для обработки образцов. После центрифугирования, чтобы взять супернатант, действовать в соответствии с процедурой определения. Рассчитайте ΔA = (A1T-A2T)-(A1B-A2B)"=" (1.041-0.963)-0= 0,078. Активность фермента рассчитывается в соответствии с массой образца.

Активность ПФП (U/g свежий вес) = 53,59 × ΔA ÷ W = 41,8 U/G Свежий вес.

Сопутствующие товары:

BC0990/BC0995 Набор для анализа содержания хлорофилла растений

BC2210/BC2215 Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа(GAPDH) Набор для анализа активности

BC4330/BC4335