Solarbio 피로인산염: 과당 6-인산-1 포스포트랜스퍼라제 분석 키트

기인하다	세부
메모	테스트 전에 예측을 위해 2~3개의 서로 다른 샘플을 채취합니다.
탐지 장비	분광 광도계
고양이 번호	BC3400
크기	50T/48S

구성요소:

용액 추출: 55밀리리터 × 1, 저장 4 ℃.

시약 1: 40밀리리터 × 1, 저장 4 ° C 및 빛으로부터 보호됩니다.

시약 2: 분말× 1, 저장 -20 ° C 및 빛으로부터 보호됩니다. 사용 직전, 추가하다 6 증류수의 ml를 완전히 용해시킵니다. 사용하지 않는 시약은 보관됩니다 -20 °C 1 반복적 인 동결-해동 사이클을 피하기 위해 분배 한 지 일주일.

시약 3: 분말 × 1, 저장 -20 ° C 및 빛으로부터 보호됩니다. 사용 직전, 추가하다 6 증류수의 ml를 완전히 용해시킵니다. 사용하지 않는 시약은 보관됩니다 -20 분배 후 ° C. 반복 된 동결-해동 사이클 금지.

시약 4: 91µL × 2, 저장 4 ° C 및 빛으로부터 보호됩니다. 사용 직전, 추가하다 0.209 증류수의 ml를 완전히 용해시킵니다. 저장 4 °C 1 주.

시약 5: 분말× 2, 저장 -20 ° C 및 빛으로부터 보호됩니다. 사용 직전, 추가하다 0.3 증류수의 ml를 완전히 용해시킵니다. 사용하지 않는 시약은 보관됩니다 -20 °C 1 분배 후 일주일.

시약 6: 60 µL × 1, 저장 4 ° C 및 빛으로부터 보호됩니다. 사용 직전, 추가하다 0.6 증류수의 ml를 완전히 용해시킵니다. 저장 4 °C 1 주.

제품 설명:

피로인산염: 과당 -6- 포스페이트 -1- 포스 포 트랜스퍼 라제 (PFP, EC2.7.1.90) 식물 조직에 널리 존재하고 포스 포 프로 루토 키나 제와 같은 과당 -6- 포스페이트의 인산화를 촉매하는 세포질 효소이다.. 결과적으로, 단일 PEP 촉매 반응은 가역적 반응이다, 피로 포스페이트는 ATP 대신 사용됩니다, 광합성의 탄소 대사에서 중요한 역할을하는.

PFP는 과당 6- 포스페이트의 과당 1,6- 디포 스테로의 전환을 촉진합니다., 알 돌라 제 및 트리오스 포스페이트 이성질 라제의 작용에 의해 디 하이드 록시 아세톤 포스페이트로 전환된다., 그런 다음 α- 포스페이트 글리세롤 데 하이드로게나 제 및 NADH에 의해 글리세롤 3- 디포 스페이트 및 NAD로 촉매. 흡수의 변화 340 NM은 PFP 활성의 수준을 반영합니다.

필요한 자료

저온 원심 분리기, 분광 광도계, 수조/일정한 온도 인큐베이터, 모르타르/균질화기, 1 mL 석영 큐벳, 이송 피펫, 얼음과 증류수, EP 튜브.

절차:

나. 견본 추출:

1. 1. 조직 샘플:

조직의 질량에 따르면 (g): 추출 용액의 부피 (밀리리터) ~이다 1: 5 ~ 10. 1ml의 추출물 용액으로 0.1g의 조직을 제안했다. 얼음 위에 완전히 갈아 둡니다, 20000g 및 4 ℃에 원심 분리 하였다 15 분. 상청액은 테스트를 위해 얼음 위에 놓습니다.

2. 박테리아 또는 세포:

세포 수에 따르면 (104): 추출 용액의 부피 (밀리리터) ~이다 500 ~ 1000: 1. 추천하다 5 1ml의 추출 용액으로 백만. 초음파를 사용하여 박테리아 나 세포를 분할하십시오 (전력 300W, 작업시간 3초, 간격 7초, 총 시간 3 분). 원심 분리, 20000G와 4. 15 분. 상청액은 테스트를 위해 얼음 위에 놓습니다.

3. 액체: 직접 탐지.

II. 결정 절차:

• 분광 광도계를 예열하십시오 30 분, 파장을 조정하다 340 nm, 증류수로 0을 설정하다
• 다음 목록으로 시약을 추가하세요.:

시약명 (μL)	시험관 (티)	빈 튜브 (티)
시약 1	670	670
시약 2	100	100
시약 3	100	100
시약 4	10	10
시약 5	10	10
시약 6	10	10
견본	100	–
증류수	–	100
잘 섞은 후, 초기 값 A1을 측정하십시오 340 NM 및 흡광도 A2에 대한 30 분 37 ° C a 1 mL 석영 큐벳, A1T로 기록하십시오, A1B, 및 A2T, A2B. ΔA =를 계산하십시오 (A1T-A2T)- (A1B-A2B). 메모: 시약 1, 2, 3, 4, 5, 그리고 6 작동 테이블의 비율에 따라 작동 유체로 제조 될 수 있습니다., 이제 사용 준비가되었습니다; 빈 튜브는 만 있으면됩니다 1-2 번 만들었습니다.

III. PFP 계산 활동:

1 Micro Quartz Cuvette에 의해 계산됩니다

• 단백질 농도에 의해 계산됩니다:

단위 정의: 효소 활성의 한 단위는 그로 정의됩니다 1 분당 조직 단백질의 mg 1 NADH의 NMOL.

PFP 활동 (U/mg 프로트) = ΔA ÷ ÷ (ε × d] × VRT × 109 ÷(VS×심폐소생술) ÷ t = 53.59 × ΔA ÷ CPR

• 샘플 중량으로 계산됩니다

단위 정의: 효소 활성의 한 단위는 분당 1g의 조직이 소비되는 것으로 정의됩니다. 1 NADH의 NMOL.

PFP 활동 (U/g 신선 중량) = ΔA ÷ ÷ (ε × d] × VRT × 109 ÷(W × VS ÷ VE) ÷ t = 53.59 × ΔA ÷ w

• 박테리아 또는 세포 양에 의해 계산됩니다:

단위 정의: 효소 활성의 한 단위는 그로 정의됩니다 10 분당 천 개의 박테리아 또는 세포가 소비됩니다 1 NADH의 NMOL.

PFP 활동 (U/104 셀) = ΔA ÷ ÷ (ε × d] × VRT × 109 ÷(vs × n ÷ ve) ÷ t = 53.59 × ΔA ÷ N − (104)

• 혈청 및 기타 액체에 의해 계산됩니다:

단위 정의: 효소 활성의 한 단위는 그로 정의됩니다 1 분당 액체의 ml가 소비됩니다 1 NADH의 NMOL.

PFP 활동 (U/mL) = ΔA ÷ ÷ ay (ε × d 찾고 × vrt × 109 ÷ t = 53.59 × Δa

VRT: 총 반응 시스템의 총 부피, 0.001 엘;

이자형: NADH 어금니 멸종 계수, 6.22 × 103 L/몰/cm; 디: 큐벳 라이트 경로, 1 센티미터;

VS: 추가 샘플 볼륨, 0.1 밀리리터;

VE: 추출 용액의 부피가 추가되었습니다, 1 밀리리터; 티: 반응 시간, 30 분;

심폐소생술: 샘플 단백질 농도, mg/mL; 여: 샘플 질량, 0.1 g;

109:변환 계수, 1 mol = 109 nmol n: 셀 수

2. 96- 웰 UV 플레이트로 계산:

d =를 수정하십시오 1 위의 공식에서 cm d-0.6 센티미터 (96- 웰 플레이트의 가벼운 경로) 계산을 위해.

메모:

1. 효소 반응 시간을 지연시키지 않기 위해 샘플 수가 너무 크지 않아야합니다..

실험예:

1. 가져가다 0.1 콩 콩나물의 G와 추가 1 샘플 처리를위한 추출 용액의 ML. 원심 분리 후 상청액을 복용합니다, 결정절차에 따라 진행. ΔA = 계산하십시오 (A1T-A2T)-(A1B-A2B)= (1.041-0.963)-0= 0.078. 효소 활성은 샘플 질량에 따라 계산됩니다..

PFP 활동 (U/g 신선 중량) = 53.59 × ΔA ÷ W = 41.8 U/G 신선한 무게.

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