Атрибут	Подробности
Примечание	Перед тестированием возьмите два или три разных образца для прогнозирования.
Операционное оборудование	Спектрофотометр
Кот нет	BC3230
Размер	25Т/24С; 50Т/48С

Компоненты:

Экстракт раствора: 80мл × 1. Хранение при 4℃.

Реагент 1: 40мл × 1. Хранение при 4℃.

Реагент 2: Порошок×1. Хранение при -20℃, растворить с 1 мл ацетона. Растворенный реагент 2 можно хранить в -20 ℃ после дозирования. Разбавить 100 раз, когда используется.

Реагент 3: Порошок×1. Хранение при 4℃, растворить 3 мл ацетона перед использованием. Реагент 4: 5мл × 1. Хранение при 4℃.

Описание продукта:

Митохондриальный комплекс II такой же, как и сукцинат-ко-анзимент Q редуктаза, который широко существует в митохондриях животных, растение, микроорганизмы и культивируемые клетки. Он катализирует сукциновую кислоту с образованием фумариновой кислоты, уменьшить увлечение, чтобы сформировать FADH2. FADH2 уменьшает окисленный COQ с образованием пониженного COQ, которая является ветвью дыхательной электронной транспортной цепи.

COQ, что каталитическое произведение комплекса II может уменьшить 2,6-дихлордофенол, который обладает поглощением в 605 нм, активность фермента может быть рассчитана путем обнаружения скорости уменьшения 2, 6-Дихлордолефено.

Требуемые реагенты и оборудование, которые не входят в комплект поставки:

Спектрофотометр, водяная баня, настольная центрифуга, пипетка для переноса, 1ML Стеклянная кювета, ступка/гомогенизатор, ацетон, лед и дистиллированная вода.

1. Комплекс II добыча:

• Сбор 0,1 г ткани или 5 миллион клеток, Добавить 1 мл раствора экстракта и измельчить на льду с помощью раствора/гомогенизатора;
• центрифуга в 600 г и 4 ℃ для 10 мин. Отбросьте осадок и перенесите супернатант в другую трубку, центрифуга в, 11000G и 4 ℃ для 15 мин;
• Супернатант, то есть, цитоплазматический экстракт, можно использовать для определения утечки комплекса II из митохондрий, Этот шаг может показать эффект митохондриальной экстракции;
• Добавлять 400 мкл экстракционный раствор до отложений, расщепление с ультразвуком (власть 20%, рабочее время 5 с, интервал 10 с, повторить 15 раз), используется для обнаружения комплексной ⅱ активности и содержания белка.

Определение шага

1. Предварительно разогрейте спектрофотометр для 30 мин, отрегулировать длину волны, чтобы 605 нм, обнулить счетчик дистиллированной
2. Определение образца

• Создание рабочего решения: Смешайте реагент 2 и реагент 3 в соответствии с 1:1 перед использованием. Приготовьтесь при использовании. Подготовлен, когда будет использовано решение.
• Разогрейте реагент1 на 37 ℃ (млекопитающие) или 25℃(другие виды) для 15
• Добавить следующие реагенты в 1 мл стеклянной кювете:

Название реагента (ул)	Пробирка (А1)
Образец	50
Реагент 1	750
Рабочее решение	100
Реагент 4	100
Добавить вышеупомянутый реагент в 1 мл стеклянной кюветы, тщательно перемешать, обнаружить поглощение при 10 с. (А1). Положите кювет и реагировать раствор вместе в 37 ℃(млекопитающее) или 25℃(другие виды) водяная баня для 2 мин, Затем быстро возьмите кювет, сушить и обнаружить поглощение для 2 мин (А2), ΔA = A1-A2

Расчет:

Определение единицы измерения: Одна единица ферментной активности определяется как количество фермента, который катализирует потребление 1nmol 2, 6-дихлордолефено на мг белка ткани в каждой минуте.

Сложная ⅱ активность (Ед/мг прот)"="[ΔA × VRV ÷(ε×d)× 109]÷(Vs×Cpr)÷ t = 476,2 × ΔA ÷ cpr

е: 2, 6-коэффициент молярного вымирания дихлордолефено, 2.1× 104L/моль/см; д: легкий путь кювета, 1 см;

Веревка: Общий объем реакции,1мл; Против: объем пробы (мл), 0.05 мл;

КПР: концентрация белка в образце (мг/мл); Т: время реакции (мин), 2 мин;

Примечание:

1. Возьмите два или три разных образца для прогнозирования перед тестированием, чтобы обеспечить точность экспериментальных результатов. Разбавить супернатант дистиллированной водой, если поглощение выше, чем 1.5. Разбавить образец дистиллированной водой, если ΔA>0.4, умножьте разбавление в формуле. Увеличить объем выборки, если ΔA медленно.
2. Выявляйте образец концентрата белка самостоятельно, Вы можете использовать Соларбио (ПК0020 БСА-белок Набор для анализа). Потому что белок содержится в экстракте, Содержание белка в самом экстракте должно быть вычтено при определении концентрации белка образца.
3. Рекомендуется использовать концентрацию белка образца для расчета активности фермента. Если для расчета используется свежий вес образца свежего веса, необходимо измерить ферментативную активность цитоплазматического экстракта, и сумма активности ферментов супернатанта и осадков является общей ферментной активностью.
4. Этого достаточно для 50 трубчатые реакции.
5. Вложение: Вес образца(50Т/24С)

• Супернатант:

Определение единицы измерения: Одна единица ферментной активности определяется как количество фермента, который катализирует потребление 1nmol 2, 6-Дихлордолефено в 1 Мин.

Сложная ⅱ активность(Ед/г)"="[ΔA1 × VRV ÷(ε×d)× 109]÷(Вт÷Ve×Vs)÷ t = 476,2 × ΔA1 ÷ w ΔA1: супернатант поглощение;

Веревка: Общий объем реакции,1мл;

е: 2, 6-коэффициент молярного вымирания дихлордолефено, 2.1× 104L/моль/см; д: легкий путь кювета, 1 см;

ве: Извлеките объем раствора,1мл; Против: объем пробы (мл), 0.05 мл; Т: время реакции (мин), 2 мин;

Вт: Выборочный вес, г.

• Осадок:

Определение единицы измерения: Одна единица ферментной активности определяется как количество фермента, который катализирует потребление 1nmol 2, 6-Дихлордолефено в 1 Мин.

Сложная ⅱ активность(Ед/г)"=" [ΔA2 × VRV ÷(ε×d)× 109]÷(Вт÷Ve×Vs)÷ t = 190,5 × ΔA2 ÷ w ΔA2: Поглощение отложений;

Веревка: Общий объем реакции,1мл;

е: 2, 6-коэффициент молярного вымирания дихлордолефено, 2.1× 104L/моль/см; д: легкий путь кювета, 1 см;

ве: Осадочный объем ресуспендирования,0.4 мл; Против: объем пробы (мл), 0.05 мл;

Т: время реакции (мин), 2 мин; Вт: Выборочный вес, г.

• Общая активность - это сумма комплексной активности в супернатанте и осадках. Комплекс ⅱ(Ед/г) = 476,2 × ΔA1 ÷ W+190,5 × ΔA2 ÷ W..

Экспериментальный пример:

1. Взять 0,1 г образца печени кролика, добавлять 1 мл раствора экстракта, размолоть и центрифугировать гомогенат, и работать в соответствии с этапами определения. ΔA1 = A1-A2 = 1.134-1.054 "=" 0.08 в супернатанте, и ΔA2 = A1-A2 = 1.371-1.347 "=" 0.024 в осадках.

Активность комплекса II в супернатанте (Ед/г массы) = 476,2 × ΔA1 ÷ w = 476.2 × 0,08 ÷ 0,1 = 380.96 Ед/г массы

Активность комплекса II в осадках (Ед/г массы) = 190,5 × ΔA2 ÷ w = 190,5 × 0,024 ÷ 0,1 = 45.72

Ед/г массы

Комплекс II (Ед/г массы) = 476,2 × ΔA1 ÷ w + 190.5× ΔA2 ÷ w = 476,2 × 0,08 ÷ 0,1 + 190.5× 0,024 ÷ 0.1 = 426.8u/g масса.

Рекомендации：

[1] Mühling J., Тифенбах м, Лопес-Барнео J., и другие. Митохондриальный комплекс II участвует в нормоксической и гипоксической регуляции α-кето кислот в мышином сердце[Дж]. Журнал молекулярной и клеточной кардиологии, 2010, 49(6): 950-961.

сопутствующие товары：

BC0510/BC0515 Электронный транспортный цепной цепной цепь комплект A Activessay

BC3240/BC3245 Электронный транспортный цепный комплекс ⅲ Набор анализа активности

BC0940/BC0945 Электронный комплекс цепного цепи ⅳ Набор для анализа активности

BC1440/BC1445 Электронный транспортный цепный комплекс ⅴ Набор анализа активности