기인하다	세부
메모	테스트 전에 예측을 위해 2~3개의 서로 다른 샘플을 채취합니다.
운영장비	분광 광도계
고양이 번호	BC3230
크기	25T/24S; 50T/48S

구성요소:

용액 추출: 80ML × 1. 4℃에서 보관.

시약 1: 40ML × 1. 4℃에서 보관.

시약 2: 가루×1. -20℃에서 보관, 1ml의 아세톤으로 용해시킵니다. 용해 된 시약 2 분배 후 -20 ℃에서 보관할 수있다. 묽게 한 100 사용되는 시간.

시약 3: 가루×1. 4℃에서 보관, 사용하기 전에 3ML의 아세톤으로 용해시킵니다. 시약 4: 5ML × 1. 4℃에서 보관.

제품 설명:

미토콘드리아 복합체 II, 이는 동물의 미토콘드리아에 널리 존재합니다, 식물, 미생물과 배양세포. 푸마르 산을 형성하기 위해 숙신산을 촉매합니다, FAD를 줄이려 FADH2를 형성하십시오. FADH2는 산화 된 COQ를 감소시켜 감소 된 COQ를 형성한다, 호흡기 전자 수송 체인의 지점입니다.

복합체 II의 촉매 생성물이 2,6- 디클로로 인도 페놀을 감소시킬 수 있다는 COQ, 흡광도가 있습니다 605 nm, 효소의 활성은 감소 속도를 감지하여 계산할 수 있습니다. 2, 6-디클로린 딜레 페노.

필요하지만 제공되지 않는 시약 및 장비:

분광 광도계, 욕조, 책상 원심분리기, 이송 피펫, 1ML 유리 큐벳, 모르타르/균질화기, 아세톤, 얼음과 증류수.

1. 복잡한 II 추출:

• 조직 또는 0.1g의 수집 또는 5 백만개의 세포, 1ml 추출물 용액을 추가하고 박격포/균질화 제로 얼음 위에 갈아줍니다.;
• 600g 및 4 ℃에서 원심 분리하십시오 10 분. 침전물을 버리고 상청액을 다른 튜브로 옮깁니다, 원심분리기, 11000G와 4. 15 분;
• 상청액, 즉., 세포질 추출물, 미토콘드리아에서 복잡한 II 누출을 결정하는 데 사용할 수 있습니다., 이 단계는 미토콘드리아 추출의 효과를 보여줄 수 있습니다;
• 추가하다 400 침전물에 대한 μl 추출 용액, 초음파로 분할 (힘 20%, 작업 시간 5s, 간격 10초, 반복하다 15 타임스), 복잡한 complex 활성 및 단백질 함량을 감지하는 데 사용됩니다.

결정 단계

1. 예열 분광 광도계 30 분, 파장을 조정하여 605 nm, 증류수로 카운터를 0으로 설정
2. 샘플 결정

• 작업 솔루션 만들기: 시약을 혼합하십시오 2 그리고 시약 3 ~에 따르면 1:1 사용하기 전에. 사용하면 준비하십시오. 용액이 사용될 때 준비.
• 37 ℃에서 시약 1을 예열하십시오 (포유류 세포) 또는 25℃(다른 종) ~을 위한 15
• 1ml 유리 큐벳에 다음 시약을 추가하십시오:

시약명 (uL)	시험관 (A1)
견본	50
시약 1	750
작업 솔루션	100
시약 4	100
위의 시약을 1ml 유리 큐벳에 추가하십시오, 잘 섞는다, 10에서 흡광도를 감지합니다 (A1). Cuvette와 React Solution을 37 ℃로 결합시킵니다(포유 동물) 또는 25℃(다른 종) 수욕 2 분, 그런 다음 큐벳을 빨리 가져 가십시오, 흡광도를 건조시키고 감지합니다 2 분 (A2), ΔA = A1-A2

계산:

단위 정의: 효소 활성의 한 단위는 1nmol의 소비를 촉매하는 효소의 양으로 정의됩니다. 2, 6-1 분마다 조직 단백질의 mg 당 디클로린 딜레 페노.

복잡한 ⅱ 활동 (U/mg 프로트)=[ΔA × VRV ÷(ε×d)× 109]¶(VS×심폐소생술)÷ t = 476.2 × ΔA ÷ CPR

이자형: 2, 6-Dichlorindolepheno 어금니 멸종 계수, 2.1× 104L/mol/cm; 디: 큐벳의 가벼운 경로, 1 센티미터;

로프: 총 반응 부피,1밀리리터; 대: 샘플량 (밀리리터), 0.05 밀리리터;

심폐소생술: 샘플 단백질 농도 (mg/mL); 티: 반응 시간 (분), 2 분;

메모:

1. 실험 결과의 정확성을 보장하기 위해 테스트 전에 예측을 위해 2 ~ 3 개의 다른 샘플을 섭취하십시오.. 흡광도가 더 높은 경우 증류수로 희석 된 상청액 1.5. ΔA 인 경우 증류수로 샘플을 희석하십시오>0.4, 공식에서 희석 시간을 곱하십시오. ΔA가 느리면 샘플 부피를 증가시킵니다.
2. 샘플 단백질 농축을 혼자서 감지하십시오, 당신은 사용할 수 있습니다 솔라바이오 (PC0020 BCA 단백질 분석 키트). 단백질은 추출물에 포함되기 때문입니다, 샘플의 단백질 농도를 결정할 때 추출물 자체의 단백질 함량을 빼야합니다..
3. 효소 활동을 계산하기 위해 샘플 단백질 농도를 사용하는 것이 좋습니다.. 샘플 신선한 무게를 사용하여 계산하는 경우, 세포질 추출물의 효소 활성을 측정해야합니다, 및 상청액 및 침전 효소 활성의 합은 총 효소 활성이다..
4. 충분합니다 50 튜브 반응.
5. 부착: 샘플 중량(50T/24S)

• 상청액:

단위 정의: 효소 활성의 한 단위는 1nmol의 소비를 촉매하는 효소의 양으로 정의됩니다. 2, 6-Dichlorindolepheno 1 조직 무게의 모든 그램.

복잡한 ⅱ 활동(U/g)=[ΔA1 × VRV ÷(ε×d)× 109]¶(W²Ve×Vs)÷ t = 476.2 × ΔA1 ÷ W ΔA1: 상청액 흡광도;

로프: 총 반응 부피,1밀리리터;

이자형: 2, 6-Dichlorindolepheno 어금니 멸종 계수, 2.1× 104L/mol/cm; 디: 큐벳의 가벼운 경로, 1 센티미터;

베: 솔루션 볼륨 추출,1밀리리터; 대: 샘플량 (밀리리터), 0.05 밀리리터; 티: 반응 시간 (분), 2 분;

여: 샘플 중량, g.

• 침전물:

단위 정의: 효소 활성의 한 단위는 1nmol의 소비를 촉매하는 효소의 양으로 정의됩니다. 2, 6-Dichlorindolepheno 1 조직 무게의 모든 그램.

복잡한 ⅱ 활동(U/g)= [ΔA2 × VRV ÷(ε×d)× 109]¶(W²Ve×Vs)÷ t = 190.5 × ΔA2 ÷ W ΔA2: 퇴적물 흡수;

로프: 총 반응 부피,1밀리리터;

이자형: 2, 6-Dichlorindolepheno 어금니 멸종 계수, 2.1× 104L/mol/cm; 디: 큐벳의 가벼운 경로, 1 센티미터;

베: 퇴적물 재현방 부피,0.4 밀리리터; 대: 샘플량 (밀리리터), 0.05 밀리리터;

티: 반응 시간 (분), 2 분; 여: 샘플 중량, g.

• 총 활동은 상청액 및 퇴적물에서 복잡한 활동의 ​​합입니다.. 복잡한 ⅱ(U/g) = 476.2 × ΔA1 ÷ W+190.5 × ΔA2 ÷ W..

실험예:

1. 0.1g의 토끼 간 샘플을 복용하십시오, 추가하다 1 mL의 추출 용액, 균질을 갈고 원심 분리하십시오, 결정 단계에 따라 작동합니다. ΔA1 = A1-A2 = 1.134-1.054 = 0.08 상청액에서, 및 ΔA2 = A1-A2 = 1.371-1.347 = 0.024 강수에서.

상청액에서 복합 II의 활동 (U/g 질량) = 476.2 × ΔA1 ÷ W = 476.2 × 0.08 ÷ 0.1 = 380.96 U/g 질량

강수량에서 복합 II의 활동 (U/g 질량) = 190.5 × ΔA2 ÷ W = 190.5 × 0.024 ÷ 0.1 = 45.72

U/g 질량

복잡한 II (U/g 질량) = 476.2 × ΔA1 ÷ w + 190.5× ΔA2 ÷ W = 476.2 × 0.08 ÷ 0.1 + 190.5× 0.024 ÷ 0.1 = 426.8U/g 질량.

참고자료：

[1] Mühling J, Tiefenbach m, López-Barneo j, 외. 미토콘드리아 복합체 II는 뮤린 심장에서 α- 케토 산의 정상 및 저산소 조절에 참여합니다.[제이]. 분자 및 세포 심장학 저널, 2010, 49(6): 950-961.

관련 상품：

BC0510/BC0515 전자 운송 체인 복합체 I 활동 분석 키트

BC3240/BC3245 전자 운송 체인 복합체 ⅲ 활성 분석 키트

BC0940/BC0945 전자 운송 체인 복합체 ⅳ 활성 분석 키트

BC1440/BC1445 전자 운송 체인 복합체 ⅴ 활성 분석 키트