Solarbio ATP ADP AMP Content Набор для анализа ВЭЖХ 50T | 48С

Примечание: Перед тестом возьмите два или три разных образца для прогнозирования.. Операционное оборудование: Высокоэффективная жидкостная хроматография Номер каталога: BC5114

Размеры：50Т/48С

Компоненты:

Экстракт раствора I: 80 мл×1. Хранение при 2-8℃.

Экстракт раствора II：40 мл×1. Хранение при 2-8℃.

Реагент I: 15 мл×1. Хранение при 2-8℃. Перед использованием, брать 3.5 мл реагента I и добавьте его в 1000 мл сверхчистой воды, отрегулировать его pH до 6.15 с реагентом II с образованием подвижной фазы B, и запечатать его.

Реагент II:10 мл ×1. Хранение при 2-8℃.

Стандарт АТФ： Порошок×1. Хранение при -20℃. Перед использованием, 1.8 Для приготовления добавляется мл дистиллированной воды. 1 мкмоль / мл стандартного раствора АТФ, который был заморожен в -20 °С. Для обеспечения целостности АТФ, избегать многократного замораживания и оттаивания.

Стандарт АДП： Порошок×1. Хранение при -20℃. Перед использованием, 2.34 Для приготовления добавляется мл дистиллированной воды. 1 мкмоль / мл стандартного раствора АТФ, который был заморожен в -20 °С. Для обеспечения целостности АТФ, избегать многократного замораживания и оттаивания.

Стандарт AMP： Порошок×1. Хранение при -20℃. Перед использованием, 2.0 Для приготовления добавляется мл дистиллированной воды. 1 мкмоль / мл стандартного раствора АТФ, который был заморожен в -20 °С. Для обеспечения целостности АТФ, избегать многократного замораживания и оттаивания.

Описание продукта：

Нуклеотиды выполняют важные биологические функции.. Это класс соединений, состоящих из трех веществ.: пуриновое основание или пиримидиновое основание, рибоза или дезоксирибоза, и фосфорная кислота. В основном они участвуют в образовании нуклеозидов..

Аденозинтрифосфат (СПС) считается универсальным источником энергии, который необходим для синтеза клеток, выживания и размножения всех организмов.. АТФ может вырабатываться различными клеточными путями.. Наиболее типичным примером является синтез аденозинтрифосфатсинтазой путем окислительного фосфорилирования в митохондриях., или синтез путем фотосинтеза в хлоропластах растений. Основными источниками энергии для синтеза АТФ являются глюкоза и жирные кислоты..

Аденозиндифосфат (АДП) широко присутствует у животных, растения, микроорганизмы, и культивируемые клетки. В организмах, АДФ – продукт разрыва высокоэнергетической фосфатной связи. (СПС) гидролизуется с потерей фосфатного радикала) и высвобождение энергии.

Аденозинмонофосфат (AMP) широко встречается у животных, растения, микроорганизмы, и культивируемые клетки. Он образуется после того, как АТФ и АДФ высвобождают энергию в организме.. Он может продолжать связывать фосфатные группы с образованием аденозиндифосфата. (АДП) и аденозинтрифосфат (СПС). Это продукт неполного гидролиза АТФ..

СПС 、 АДП 、 AMP имеют пик поглощения при 254 нм, и их содержание можно определить методом высокоэффективной жидкостной хроматографии..

Требуемые реагенты и оборудование, которые не входят в комплект поставки：

Высокоэффективный жидкостный хроматограф (Колонка C18 (4.6×250 мм), ультрафиолетовый детектор (БВД)), настольная центрифуга, регулируемая пипетка, ступка/гомогенизатор, коричневая EP-трубка, 50 шприцевые фильтры (вода, 0.45

мкм), шприц, всасывающий фильтр, мембранный фильтр (органический, вода), 50 коричневый флакон для инъекций (2 мл), ацетонитрил (хроматографически чистый, 500 мл), сверхчистая вода.

Подготовка перед экспериментом:

1. Использовать 500 мл хроматографически чистого ацетонитрила (подвижная фаза А) и 1000 мл настроенной подвижной фазы B для фильтрации с помощью фильтрующей мембраны для удаления примесей из растворителя и предотвращения засорения хроматографической колонки.. (Ацетонитрил использует 0.45 Мембрана органического фильтра мкм для всасывающей фильтрации, и сконфигурированная мобильная фаза B использует 0.22 Мембрана водного фильтра для всасывающей фильтрации).
2. Проведите ультразвуковое исследование подготовленных подвижных фаз A и B для 30 минут, чтобы удалить газ из растворителя, чтобы предотвратить засорение хроматографической колонки и влияние на экспериментальный результат.
3. Подготовка стандарт АТФ: 1 мкмоль/мл Стандартный раствор АТФ разбавляют дистиллированной водой до 0.5 мкмоль/мл, 0.1 мкмоль/мл, 0.05 мкмоль/мл, 0.01 мкмоль/мл, 0.005 мкмоль/мл стандартный раствор АТФ. (Концентрация приготовленного стандарта предназначена только для справки и может быть скорректирована в соответствии с фактической концентрацией образца.). Стандарт фильтруют с помощью водного шприцевого фильтра в коричневый инъекционный флакон для тестирования. (пожалуйста, поместите его при комнатной температуре перед тестированием, чтобы не влиять на время хранения).
4. Подготовка стандарт АДП: 1 мкмоль/мл Стандартный раствор АДФ разбавляют дистиллированной водой до 0.5 мкмоль/мл, 0.1 мкмоль/мл, 0.05 мкмоль/мл, 0.01 мкмоль/мл, 0.005 мкмоль/мл стандартный раствор АДФ. (Концентрация приготовленного стандарта предназначена только для справки и может быть скорректирована в соответствии с фактической концентрацией образца.). Стандарт фильтруют с помощью водного шприцевого фильтра в коричневый инъекционный флакон для тестирования. (пожалуйста, поместите его при комнатной температуре перед тестированием, чтобы не влиять на время хранения).
5. Подготовка стандарт AMP: 1 мкмоль/мл Стандартный раствор AMP разбавляют дистиллированной водой до

0.5 мкмоль/мл, 0.1 мкмоль/мл, 0.05 мкмоль/мл, 0.01 мкмоль/мл, 0.005 мкмоль/мл стандартный раствор AMP. (Концентрация приготовленного стандарта предназначена только для справки и может быть скорректирована в соответствии с фактической концентрацией образца.). Стандарт фильтруют с помощью водного шприцевого фильтра в коричневый инъекционный флакон для тестирования. (пожалуйста, поместите его при комнатной температуре перед тестированием, чтобы не влиять на время хранения).

Процедура

1. Базовые приготовления:

• • Образец ткани: По соотношению тканей (г): извлечь раствор I (мл) "=" 1:5~10 (рекомендуется взвесить 3 г образца ткани и добавьте 1.5 мл раствора экстракта I) добавить раствор экстракта I, гомогенат на льду, и экстрагировать на ледяной бане 40 мин. Центрифуга в 10000 об/мин для 10 мин. при 4°C, возьмите 750 мкл супернатанта, добавьте 750 мкл экстракта II, хорошо встряхнуть (5 мин) и хорошо перемешать, снова центрифугировать в 10000 об/мин при 4°C для 10 мин, и отфильтровать надосадочную жидкость с помощью водного шприцевого фильтра в коричневый инъекционный флакон для тестирования при комнатной температуре. (в пределах 2 час).
  • Образец клеток: По соотношению 10 миллион клеток (единицы): извлечь раствор I (мл)= 1000~500:1 (рекомендуется взять 10 миллионов образцов клеток и добавить 1 мл раствора экстракта I) добавить экстракционный раствор I, ультразвуковое разрушение клеток на льду (мощность 300 Вт, УЗИ для 3 секунды, интервал 7 секунды, общее время 3 минуты); центрифуга при 4 ℃, 10000 об/мин для 10 минуты, возьмите 750 мкл супернатанта, добавьте 750 мкл экстракта II, хорошо встряхнуть (5 мин) и хорошо перемешать, снова центрифугировать в 10000 об/мин при 4°C для 10 мин, и отфильтровать надосадочную жидкость с помощью водного шприцевого фильтра в коричневый инъекционный флакон для тестирования при комнатной температуре. (в течение 2 часов).
  • сыворотка: Рекомендуется принять 0.4 мл образца сыворотки, добавлять 0.6 мл экстракционного раствора 1, и извлечь для 40 мин в ледяной бане. Центрифуга в 10000 об/мин для 10 мин. при 4°C, возьмите 750 мкл супернатанта, добавьте 750 мкл экстракта II, хорошо встряхнуть (5 мин) и хорошо перемешать, снова центрифугировать в 10000 об/мин при 4°C для 10 мин, и отфильтровать надосадочную жидкость с помощью водного шприцевого фильтра в коричневый инъекционный флакон для тестирования при комнатной температуре. (в течение 2 часов).

2. Определение процедура：

1. Включите компьютер, включить кнопки переключения каждого модуля ВЭЖХ, установить хроматографическую колонку, открыть программное обеспечение, и установите объем инъекции в группе методов на 10 мкл., температура колонки: 27°С, скорость потока 0.8 мл/мин, и длина волны 254 нм, программа элюирования показана в таблице ниже., и время выборки 70 мин. После установки, сохранить группу методов.
2. Очистите колонку подвижной фазой., уравновесить колонку подвижной фазой ацетонитрила: подвижная фаза Б (рН = 6.15) "=" 2: 98, и начните инъекцию после того, как базовый уровень стабилизируется.
3. Обнаружение приготовленного стандартного раствора, объем впрыска 10 мкл, СПС, АДП, и AMP можно разделить внутри 10 минуты, и время удерживания АТФ, АДП, и AMP — это примерно 7.8 мин, 6.7мин и 5,4 мин (pH системы, столбец, подвижная фаза, и т. д.. разные, время хранения другое, только ссылка).
4. Обнаружение приготовленного раствора образца, объем впрыска 10 мкл, и обнаружить площадь пика АТФ, АДП, и AMP при соответствующем удержании

Время		Мобильная фаза
	А		Б
0 мин	2%		98%
10 мин	2%		98%
15 мин	70%		30%
50 мин	70%		30%
55 мин	2%		98%
70 мин	2%		98%

3. Расчеты：

1. Нарисуйте стандартные кривые АТФ., АДП, AMP со стандартной концентрацией (мкмоль/мл) как x и площадь пика как y. Подставьте площадь пика образца в стандартную кривую, чтобы рассчитать АТФ., АДП, Концентрация АМФ x1, х2, х3 (мкмоль/мл) в

содержание АТФ расчет

1. Вес образца

СПС (мкмоль/г)＝2 x1×VE÷W=3 x1÷W

СПС (мкг/г）=2 x1 ×VE×551,14 ÷W=1653,42 x1÷W

ВЕ: объем раствора экстракта I, 1.5мл; Вт: Вес образца, г; МАТП: 551.14; 2: Коэффициент разбавления образца.

1. Объем жидкости:

СПС (мкмоль/мл)＝2 x1 ×VE÷VS=5×x1

СПС (мкг/мл）=2 x1 ×VE×551,14 ÷VS =2755,7 ×x1

ВЕ: объем раствора экстракта I, 1мл; МАТП: 551.14; ПРОТИВ： объем образца, 0.4мл； 2: Коэффициент разбавления образца.

1. Количество ячеек

СПС (мкмоль/104 клетки)＝2 x1 ×VE÷ N =2×x1÷ N

СПС (мкг/г104 клетки）=2 x1 ×VE×551,14 ÷N =1102,28×x1÷N

ВЕ: объем раствора экстракта I, 1мл; МАТП: 551.14; Н: количество ячеек, 104 как единица; 2: Коэффициент разбавления образца.

контент ADP расчет

1. Вес образца

АДП (мкмоль/г)＝2 x2×VE÷W=3 x2÷W

АДП (мкг/г）=2 x2 ×VE×427,2 ÷W=1281,6 x2÷W

ВЕ: объем раствора экстракта I, 1.5мл; Вт: Вес образца, г; МАДП: 427.2; 2: Коэффициент разбавления образца.

1. Объем жидкости:

АДП (мкмоль/мл)＝2 x2 ×VE÷VS=5×2

АДП (мкг/мл）=2 x2 ×VE×427,2÷VS =2136×x2

ВЕ: объем раствора экстракта I, 1мл; МАДП: 427.2; ПРОТИВ： объем образца, 0.4мл； 2: Коэффициент разбавления образца.

1. Количество ячеек

АДП (мкмоль/104 клетки)＝2 x2 ×VE÷N =0,002×2÷N

АДП (мкг/г104 клетки）=2 x2 ×VE×427,2 ÷N =854,4×x2÷N

ВЕ: объем раствора экстракта I, 1мл; МАДП: 427.2; Н: количество ячеек, 104 как единица; 2: Коэффициент разбавления образца.

AMP-контент расчет

1. Вес образца

AMP (мкмоль/г)＝2 x3×VE÷W=3 x3÷W

AMP (мкг/г）=2 x3 ×VE×499,19÷W=1497,57×3÷Вт

ВЕ: объем раствора экстракта I, 1.5мл; Вт: Вес образца, г; МАМП: 499.19; 2: Коэффициент разбавления образца.

1. Объем жидкости:

AMP (мкмоль/мл)＝2 x3 ×VE÷VS=5×x3

AMP (мкг/мл）=2 x3 ×VE×499,19÷VS =2495,95×x3

ВЕ: объем раствора экстракта I, 1мл; МАМП: 499.19; ПРОТИВ： объем образца, 0.4мл； 2: Коэффициент разбавления образца.

1. Количество ячеек

AMP (мкмоль/104 клетки)＝2 x3 ×VE÷N =2×x3÷N

AMP (мкг/г104 клетки）=2 x3 ×VE×499,19 ÷N =998,38×x3÷N

ВЕ: объем раствора экстракта I, 1мл; МАМП: 499.19; Н: количество ячеек, 104 как единица; 2: Коэффициент разбавления образца.

Примечание:

Меры предосторожности:

1. После обнаружения, хроматографическую колонку необходимо промывать сверхчистой водой высокой концентрации (о 20-30 объемы колонн) для предотвращения засорения хроматографической колонки. Окончательно, промойте колонку в соответствии с техническими характеристиками колонки, чтобы предотвратить повреждение хроматографического
2. Коэффициент разведения стандарта следует определять в зависимости от концентрации нуклеотидов в образце.. Площадь пика нуклеотидов в образце должна находиться в пределах площади пика стандартного раствора различной концентрации.. Коэффициент разбавления стандарта является лишь справочным.. Если концентрация нуклеотидов в образце слишком высока, рекомендуется предварительно разбавить
3. Образец после экстракции нестабилен при комнатной температуре., поэтому его нужно оперировать как можно скорее.
4. Если количество образцов слишком велико, рекомендуется тестировать стандартный раствор один раз в день (одного стандартного решения достаточно) чтобы определить соответствующее удержание