Kit de ensayo HPLC de contenido Solarbio ATP ADP AMP 50T | 48S

Nota: Tome dos o tres muestras diferentes para predecir antes de la prueba.. Equipo de operación: Cromatografía líquida de alto rendimiento Numero de catalogo: BC5114

Tallas：50T/48S

Componentes:

Solución de extracto I: 80 mL×1. Almacenamiento a 2-8 ℃.

Extraer solución II：40 mL×1. Almacenamiento a 2-8 ℃.

reactivo yo: 15 mL×1. Almacenamiento a 2-8 ℃. Antes de usar, llevar 3.5 ml de reactivo I y agrégalo a 1000 Ml de agua ultrapura, ajustar su pH a 6.15 con el reactivo II para formar la fase móvil B, y sellarlo.

Reactivo II:10 ml × 1. Almacenamiento a 2-8 ℃.

Estándar de ATP： Polvo × 1. Almacenamiento a -20 ℃. Antes de usar, 1.8 Se agrega agua destilada ML para prepararse 1 μmol / Solución estándar de ATP ML, que estaba congelado en -20 °C. Para garantizar la integridad de ATP, Evite la congelación y descongelación repetidas.

Estándar ADP： Polvo × 1. Almacenamiento a -20 ℃. Antes de usar, 2.34 Se agrega agua destilada ML para prepararse 1 μmol / Solución estándar de ATP ML, que estaba congelado en -20 °C. Para garantizar la integridad de ATP, Evite la congelación y descongelación repetidas.

Estándar de amplificador： Polvo × 1. Almacenamiento a -20 ℃. Antes de usar, 2.0 Se agrega agua destilada ML para prepararse 1 μmol / Solución estándar de ATP ML, que estaba congelado en -20 °C. Para garantizar la integridad de ATP, Evite la congelación y descongelación repetidas.

Descripción del Producto：

Los nucleótidos tienen importantes funciones biológicas. Son una clase de compuestos compuestos por tres sustancias: base de purina o base de pirimidina, ribosa o desoxirribosa, y ácido fosfórico. Están involucrados principalmente en la formación de nucleósidos.

Adenosina trifosfato (ATP) se considera una fuente de energía universal que es esencial para la síntesis celular en la supervivencia y la reproducción de todos los organismos. El ATP se puede producir a través de una variedad de vías celulares. El ejemplo más típico es la síntesis por la adenosina trifosfato sintasa a través de la fosforilación oxidativa en las mitocondrias, o síntesis por fotosíntesis en cloroplastos de plantas. Las principales fuentes de energía para la síntesis de ATP son la glucosa y los ácidos grasos.

Adenosina difosfato (ADP) está ampliamente presente en animales, plantas, microorganismos, y células cultivadas. En organismos, ADP es un producto de romper un vínculo de fosfato de alta energía (ATP) hidrolizado para perder un radical fosfato) y liberar energía.

Monofosfato de adenosina (AMPERIO) se encuentra ampliamente en animales, plantas, microorganismos, y células cultivadas. Se forma después de la energía de liberación de ATP y ADP en el cuerpo. Puede continuar uniendo a los grupos de fosfato para formar adenosina difosfato (ADP) y trifosfato de adenosina (ATP). Es el producto de la hidrólisis incompleta de ATP.

ATP 、 ADP 、 AMP tiene un pico de absorción en 254 Nuevo Méjico, y su contenido se puede determinar mediante cromatografía líquida de alto rendimiento.

Reactivos y equipos necesarios pero no suministrados：

Cromatógrafo líquido de alta eficiencia (Columna C18 (4.6× 250 mm), detector ultravioleta (VWD)), centrífuga de escritorio, pipeta ajustable, mortero/homogeneizador, tubo de EP marrón, 50 filtros de jeringa (agua, 0.45

µm), jeringuilla, filtro de succión, membrana de filtro (orgánico, agua), 50 botella de inyección marrón (2 mililitros), acetonitrilo (cromatográficamente puro, 500 mililitros), agua ultrapura.

Preparativos antes del experimento:

1. Usar 500 ml de acetonitrilo cromatográficamente puro (fase móvil a) y 1000 ML de la fase móvil móvil B para filtrar con una membrana de filtro para eliminar las impurezas en el solvente para evitar obstruir la columna cromatográfica. (Acetonitrilo usa un 0.45 Membrana de filtro orgánico µm para filtración de succión, y la fase móvil de móvil configurada usa un 0.22 µm de membrana de filtro acuoso para filtración de succión).
2. Ultrasonido Las fases móviles preparadas A y B para 30 minutos para eliminar el gas en el disolvente para evitar obstruir la columna cromatográfica y afectar el experimental
3. Preparación de Estándar de ATP: 1 La solución estándar de ATP μmol/ml se diluye con agua destilada para 0.5 µmol/mL, 0.1 µmol/mL, 0.05 µmol/mL, 0.01 µmol/mL, 0.005 μmol/ml de solución estándar ATP. (La concentración estándar preparada es solo para referencia y se puede ajustar de acuerdo con la concentración de muestra real). El estándar se filtra utilizando un filtro de jeringa acuosa en la botella de inyección marrón para ser probado (Por favor, colóquelo a temperatura ambiente antes de probar, para no afectar el tiempo de retención).
4. Preparación de Estándar ADP: 1 μmol/ml La solución estándar ADP se diluye con agua destilada para 0.5 µmol/mL, 0.1 µmol/mL, 0.05 µmol/mL, 0.01 µmol/mL, 0.005 Solución estándar ADP μmol/ml. (La concentración estándar preparada es solo para referencia y se puede ajustar de acuerdo con la concentración de muestra real). El estándar se filtra utilizando un filtro de jeringa acuosa en la botella de inyección marrón para ser probado (Por favor, colóquelo a temperatura ambiente antes de probar, para no afectar el tiempo de retención).
5. Preparación de Estándar de amplificador: 1 La solución estándar de μmol/ml de AMP se diluye con agua destilada para

0.5 µmol/mL, 0.1 µmol/mL, 0.05 µmol/mL, 0.01 µmol/mL, 0.005 Solución estándar de μmol/ml de amplificador. (La concentración estándar preparada es solo para referencia y se puede ajustar de acuerdo con la concentración de muestra real). El estándar se filtra utilizando un filtro de jeringa acuosa en la botella de inyección marrón para ser probado (Por favor, colóquelo a temperatura ambiente antes de probar, para no afectar el tiempo de retención).

Procedimiento

1. preparación de la muestra:

• • Muestra de tejido: De acuerdo con la relación de tejido (gramo): Solución de extracto I (mililitros) = 1:5~10 (Se recomienda pesar 3 Muestra de tejido G y agregar 1.5 Solución de extracto ml i) Para agregar la solución de extracto I, homogeneizado sobre hielo, y extraer en un baño de hielo para 40 mín.. Centrifugar en 10000 rpm para 10 min a 4 ° C., tomar 750 μl del sobrenadante, Agregue 750 μl de extracto II, agitar bien (5 mín.) y mezclar bien, centrífuga nuevamente en 10000 RPM a 4 ° C para 10 mín., y tome el sobrenadante para filtrar con un filtro de jeringa acuosa en la botella de inyección marrón para ser probado a temperatura ambiente (dentro 2 h).
  • muestra celular: Según la proporción de 10 millones de células (unidades): Solución de extracto I (mililitros)= 1000 ~ 500:1 (Se recomienda tomar 10 millones de muestras de células y agregar 1 Solución de extracto ml i) Agregar solución de extracción I, células de ruptura ultrasónica en hielo (potencia 300W, ultrasonido para 3 segundos, intervalo de 7 segundos, tiempo total de 3 minutos); centrífuga a las 4 ℃, 10000 rpm para 10 minutos, tomar 750 μl del sobrenadante, Agregue 750 μl de extracto II, agitar bien (5 mín.) y mezclar bien, centrífuga nuevamente en 10000 RPM a 4 ° C para 10 mín., y tome el sobrenadante para filtrar con un filtro de jeringa acuosa en la botella de inyección marrón para ser probado a temperatura ambiente (dentro de 2h).
  • Suero: Se recomienda tomar 0.4 muestra de suero ML, agregar 0.6 Solución de extracción de ml 1, y extraer para 40 min en un baño de hielo. Centrifugar en 10000 rpm para 10 min a 4 ° C., tomar 750 μl del sobrenadante, Agregue 750 μl de extracto II, agitar bien (5 mín.) y mezclar bien, centrífuga nuevamente en 10000 RPM a 4 ° C para 10 mín., y tome el sobrenadante para filtrar con un filtro de jeringa acuosa en la botella de inyección marrón para ser probado a temperatura ambiente (dentro de 2h).

2. Determinación procedimiento：

1. Encienda la computadora, Encienda los botones de interruptor de cada módulo del HPLC, Instale la columna cromatográfica, Abra el software, y establezca el volumen de inyección en el grupo de métodos en 10 µl, temperatura de la columna: 27°C, caudal 0.8 Ml/min, y longitud de onda 254 Nuevo Méjico, El programa de elución es como se muestra en la tabla a continuación, y el tiempo de muestreo es 70 mín.. Después de establecer, Guardar el grupo de métodos.
2. Limpiar la columna con la fase móvil, equilibrar la columna con una relación de fase móvil de acetonitrilo: fase móvil B (ph = 6.15) = 2: 98, e inicie la inyección después de que la línea de base esté estable.
3. Detectar la solución estándar preparada, El volumen de inyección es 10 µL, el ATP, ADP, y el amplificador se puede separar dentro 10 minutos, y el tiempo de retención de ATP, ADP, y el amplificador es sobre 7.8 mín., 6.7min y 5.4min (el pH del sistema, columna, fase móvil, etc.. son diferentes, El tiempo de retención es diferente, Solo referencia).
4. Detectar la solución de muestra preparada, El volumen de inyección es 10 µL, y detectar el área máxima de ATP, ADP, y amplificador en la retención correspondiente

Tiempo		Fase móvil
	A		B
0 mín.	2%		98%
10 mín.	2%		98%
15 mín.	70%		30%
50 mín.	70%		30%
55 mín.	2%		98%
70 mín.	2%		98%

3. Cálculos：

1. Dibujar curvas estándar de ATP, ADP, AMP con la concentración estándar (µmol/ml) como x y el área máxima como la y. Sustituya el área máxima de la muestra en la curva estándar para calcular el ATP, ADP, Concentración de AMP x1, x2, x3 (µmol/mL) en el

Contenido de ATP cálculo

1. Peso de la muestra

ATP (μmol/g)＝ 2 x1 × ve ÷ w = 3 x1 ÷ w

ATP (μg/g） = 2 x1 × ve × 551.14 ÷ w = 1653.42 x1 ÷ w

Ver: Volumen de solución de extracto I, 1.5mililitros; W.: Peso de la muestra, gramo; Matp: 551.14; 2: Factor de dilución de la muestra.

1. Volumen líquido:

ATP (µmol/mL)＝ 2 x1 × ves = 5 × x1

ATP (μg/ml） = 2 x1 × ve × 551.14 ÷ vs = 2755.7 × x1

Ver: Volumen de solución de extracto I, 1mililitros; Matp: 551.14; contra： Volumen de muestra, 0.4mililitros； 2: Factor de dilución de la muestra.

1. cantidad de celda

ATP (μmol/104 células)＝ 2 x1 × ve ÷ n = 2 × x1 ÷ n

ATP (μg/G104 célula） = 2 x1 × ve × 551.14 ÷ n = 1102.28 × x1 ÷ n

Ver: Volumen de solución de extracto I, 1mililitros; Matp: 551.14; norte: número de celdas, 104 como unidad; 2: Factor de dilución de la muestra.

Contenido ADP cálculo

1. Peso de la muestra

ADP (μmol/g)＝ 2 x2 × ve ÷ w = 3 x2 ÷ w

ADP (μg/g） = 2 x2 × ve × 427.2 ÷ w = 1281.6 x2 ÷ w

Ver: Volumen de solución de extracto I, 1.5mililitros; W.: Peso de la muestra, gramo; Madp: 427.2; 2: Factor de dilución de la muestra.

1. Volumen líquido:

ADP (µmol/mL)＝ 2 x2 x ve ÷ vs = 5 x2

ADP (μg/ml） = 2 x2 × ve × 427.2 ÷ vs = 2136 × x2

Ver: Volumen de solución de extracto I, 1mililitros; Madp: 427.2; contra： Volumen de muestra, 0.4mililitros； 2: Factor de dilución de la muestra.

1. cantidad de celda

ADP (μmol/104 células)＝ 2 x2 x ve ÷ n = 0.002 x2 ÷ n

ADP (Célula μg/G104） = 2 x2 × ve × 427.2 ÷ n = 854.4 × x2 ÷ n

Ver: Volumen de solución de extracto I, 1mililitros; Madp: 427.2; norte: número de celdas, 104 como unidad; 2: Factor de dilución de la muestra.

Contenido de AMP cálculo

1. Peso de la muestra

AMPERIO (μmol/g)＝ 2 x3 × ve ÷ w = 3 x3 ÷ w

AMPERIO (μg/g） = 2 x3 × ve × 499.19 ÷ w = 1497.57×3÷W

Ver: Volumen de solución de extracto I, 1.5mililitros; W.: Peso de la muestra, gramo; Gota: 499.19; 2: Factor de dilución de la muestra.

1. Volumen líquido:

AMPERIO (µmol/mL)＝ 2 x3 × ve ÷ vs = 5 × x3

AMPERIO (μg/ml） = 2 x3 × ve × 499.19 ÷ vs = 2495.95 × x3

Ver: Volumen de solución de extracto I, 1mililitros; Gota: 499.19; contra： Volumen de muestra, 0.4mililitros； 2: Factor de dilución de la muestra.

1. cantidad de celda

AMPERIO (μmol/104 células)＝ 2 x3 × ve ÷ n = 2 × x3 ÷ n

AMPERIO (μg/G104 célula） = 2 x3 × ve × 499.19 ÷ n = 998.38 × x3 ÷ n

Ver: Volumen de solución de extracto I, 1mililitros; Gota: 499.19; norte: número de celdas, 104 como unidad; 2: Factor de dilución de la muestra.

Nota:

Precauciones:

1. Después de la detección, La columna cromatográfica debe ser enjuagada con agua ultrapura de alta concentración (acerca de 20-30 volúmenes de columna) Para evitar obstruir la columna cromatográfica. Finalmente, Enjuague la columna de acuerdo con las especificaciones de la columna para evitar daños al cromatográfico
2. El factor de dilución del estándar debe determinarse de acuerdo con la concentración de nucleótidos en la muestra. El área máxima de los nucleótidos en la muestra debe estar dentro del área máxima de la solución estándar de diferentes concentraciones. El factor de dilución del estándar es solo una referencia. Si la concentración de nucleótidos en la muestra es demasiado alta, se recomienda diluirlo antes
3. La muestra después de la extracción no es estable a temperatura ambiente, Por lo tanto, debe operarse lo antes posible.
4. Si el número de muestra es demasiado grande, Se recomienda probar la solución estándar una vez al día (Una solución estándar es suficiente) para determinar la retención correspondiente